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申请/专利权人：中国科学院过程工程研究所;华兰生物工程股份有限公司

摘要：本发明提供了一种HBcAg‑VLP或HBcAg‑VLP衍生物的纯化方法，所述方法包括如下步骤：将含有HBcAg‑VLP的上样液或HBcAg‑VLP衍生物的上样液使用疏水作用层析填料处理得到纯化的HBcAg‑VLP或纯化的HBcAg‑VLP衍生物；本发明所提供的纯化方法，克服了步骤繁多、收率较低、耗材昂贵等现有方法存在的问题，仅需要一步疏水层析即可实现纯化，在不使用凝胶过滤的精制方法处理时，收率最高可达到90％以上，纯度最高可达到86％左右，大大提升了纯化效果，如果辅以进一步的凝胶过滤等精制纯化的方法，其纯度可达到99％以上，具有良好的应用前景和非常高的应用价值。

主权项：1.一种HBcAg‑VLP或HBcAg‑VLP衍生物的纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将含有HBcAg‑VLP的上样液或HBcAg‑VLP衍生物的上样液使用疏水作用层析填料处理得到纯化的HBcAg‑VLP或纯化的HBcAg‑VLP衍生物。

全文数据：一种HBcAg-VLP或HBcAg-VLP衍生物的纯化方法技术领域本发明属于生化分离领域，涉及一种HBcAg-VLP或HBcAg-VLP衍生物的纯化方法，尤其涉及一种HBcAg-VLP或HBcAg-VLP衍生物的疏水层析纯化方法。背景技术乙型肝炎病毒核心抗原HepatitisBviruscoreantigen，HBcAg是乙肝病毒的衣壳蛋白。乙肝核心抗原病毒样颗粒HBcAg-VLP是由180个或240个核心蛋白亚基自组装构成，呈正二十面体对称的颗粒结构。HBcAg-VLP不仅自身具有很强的免疫原性，而且可以作为疫苗载体，在其C端、N端以及免疫原区MIR均可以插入外源片段而不影响其组装的正确性。HBcAg-VLP为载体的疫苗如口蹄疫疫苗、疟疾疫苗等均取得了良好的效果，另外，HBcAg-VLP由于具有空壳结构，也可以用来包裹核酸以及其他的小分子物质。HBcAg-VLP作为一种研究广泛的病毒样颗粒，一直被视作分析展示外来肽链的最灵活也是最有希望的模型。纯化技术在其研究与应用进程中发挥着至关重要的作用。通常认为，纯化过程占据了生物产品整个过程70％的成本，病毒样颗粒为基础的疫苗，往往是多个亚基自组装而成的多聚体结构，因此与其他种类的疫苗纯化相比，纯化过程不仅要去除宿主蛋白、宿主DNA、内毒素等杂质，还需要去除未正确组装的病毒样颗粒，这就为病毒样颗粒的纯化带来了新的挑战。HBcAg-VLP传统的纯化方法主要包括加热预处理，硫酸铵沉淀，超滤除杂，PEG沉淀等，但是这些方法难以获得高纯度的乙肝核心抗原病毒样颗粒。密度梯度离心是目前实验室制备HBcAg-VLP采用较多的方法，采用梯度离心，不仅可以达到较高的纯度，而且可以保持颗粒的结构与免疫原性，但是梯度离心处理量有限，同时操作成本也比较高，难以应用于工业规模化生产。色谱技术具有分离效率高，应用范围广，易于放大等优点，其已经成功应用于病毒样颗粒VLPs的纯化。目前，基于色谱技术的HBcAg-VLP分离纯化中，大多集中在单个的过程单元研究，却没有形成从头到尾的完整纯化工艺。目前，虽然发展了一种完整的HBcAg-VLP的纯化工艺Expression,purificationandcharacterizationoffull-lengthRNA-freehepatitisBcoreparticles,ProteinExpressionandPurification,54200730-37，但其涉及离子交换层析，凝胶过滤层析以及亲和层析，步骤繁多，收率很低，不足10％。另外，在过程单元的研究中，也主要是针对离子交换的研究，包括利用离子填料的扩张床吸附HBcAg-VLPsDirectpurificationofrecombinanthepatitisBcoreantigenfromtwodifferentpre-conditionedunclarifiedEscherichiacolifeedstocksviaexpandedbedadsorptionchromatography,JournalofChromatographyA,1172200747-56，利用离子交换穿透式层析除去体系中的杂蛋白达到分离HBcAg-VLPs的目的NegativechromatographypurificationofhepatitisBvirus-likeparticlesusingpolyoligoethyleneglycolmethacrylategraftedcationicadsorbent,JournalofChromatographyA,14152015161-165；NegativechromatographyofhepatitisBvirus-likeparticle:Comparativestudyofdifferentadsorbentdesigns,JournalofChromatographyA,144520161-9等，离子交换填料由于其配基与颗粒之间存在较强的相互作用力，可能导致大颗粒结构的破坏而产生巨大的损失。另外，CN102199217B公开了采用Ni2+亲和层析纯化方法来纯化乙型肝炎病毒多表位融合蛋白及其制备方法与应用，该融合蛋白是在乙型肝炎病毒核心蛋白的第78-79位氨基酸之间插入由HBsAg313-321、HBsAg335-343、Pol150-159、Pol455-463和Padre表位通过连接肽串联而成的乙型肝炎病毒多表位融合肽而得到；其制备方法是先构建乙型肝炎病毒多表位融合蛋白表达质粒pET28-HBcAg-HP，再用大肠杆菌表达系统进行IPTG诱导表达，最后用亲和层析纯化即得。但是亲和色谱的载体一般较为昂贵，机械强度不够高，因此不能耐受高压，而且在洗脱的过程中，配基会发生脱落并进入分离体系，给纯化造成额外的负担。CN108047316A公开了一种重组乙肝核心抗原的分离纯化方法，该方法包含热变性澄清、硫酸铵沉淀、超滤浓缩和洗滤换液、解聚合、第一步分子筛层析、超滤浓缩、洗滤和换液、复聚和第二步分子筛层析等步骤。该方法可获得的高纯度、低宿主残留、颗粒结构均一、高度稳定的重组乙肝核心抗原。但是，此方法步骤过于繁琐，经济价值较低，不利于大规模制备。因此，目前关于HBcAg-VLP的纯化方法仍然是限制其应用的瓶颈问题，如何发展一种规模化制备HBcAg-VLP的技术是当务之急，对于拓展其应用具有重要的意义。发明内容针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种HBcAg-VLP或HBcAg-VLP衍生物的纯化方法，使得能够提升HBcAg-VLP或者其衍生物的纯化效率，纯化效果，降低生产成本，进一步达到规模化制备的目的。为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供了一种HBcAg-VLP或HBcAg-VLP衍生物的纯化方法，所述方法包括如下步骤：将含有HBcAg-VLP的上样液或HBcAg-VLP衍生物的上样液使用疏水作用层析填料处理得到纯化的HBcAg-VLP或纯化的HBcAg-VLP衍生物。本发明提供的纯化方法，从HBcAg-VLP乙肝核心抗原病毒样颗粒的结构分析着手，首先HBcAg-VLP亚基与亚基之间存在多对二硫键，稳定性好，可以耐受高温、高盐等极端条件，另外发现在颗粒表面存在大量的疏水性氨基酸，形成疏水性口袋，因此可充分利用HBcAg-VLP稳定性好以及疏水性强的特性，采用疏水层析，保证HBcAg-VLP完整颗粒结构的前提下，将HBcAg-VLP以及其衍生物吸附在层析柱或层析填料上，与其他杂质进行分离，达到提纯制备的目的。相比于目前采用离子交换层析法存在的收率低，纯度较低的问题，本发明的纯化方法在不使用凝胶过滤的精制方法处理时，收率最高可达到90％以上，纯度最高可达到86％左右，大大提升了纯化效果，如果辅以进一步的凝胶过滤等精制纯化的方法，其纯度可达到99％以上。本发明提供的纯化方法操作步骤少，仅仅需要一步疏水层析即可实现纯化；时间短，收率高，工艺稳定，重复性好，易于放大与工业化规模生产，具有较大的实际应用价值和推广前景。优选地，所述HBcAg-VLP的菌液由以下步骤制备得到：1PCR扩增表达全长的HBcAg的核苷酸序列，将扩增后的序列克隆至质粒pET21a中，获得重组质粒pET21a-HBcAg；2将重组质粒pET21a-HBcAg转入大肠杆菌表达系统，使用IPTG诱导表达后，破碎菌体，收集上清液得到所述HBcAg-VLP的上样液；优选地，所述HBcAg-VLP衍生物的菌液由以下步骤制备得到：aPCR扩增表达全长的HBcAg的核苷酸序列，将扩增后的序列克隆至质粒pET21a中，而后将目的蛋白的核苷酸序列插入到HBcAg的核苷酸序列中，获得重组质粒pET21a-HBcAg衍生物；b将重组质粒pET21a-HBcAg衍生物转入大肠杆菌表达系统，使用IPTG诱导表达后，破碎菌体，收集上清液得到所述HBcAg-VLP衍生物的上样液。在本发明中，本领域技术人员可通过构建HBcAg-VLP的工程菌或者HBcAg-VLP衍生物的工程菌，来生产HBcAg-VLP或者其衍生物。质粒一般选择pET21a，也可以选择其他质粒，例如可以是pET23a、pET28a或者pET41a等等。优选地，步骤1中所述HBcAg的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。SEQIDNO.1:ATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGCTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCTGCTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTTGCCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGGGACCGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGCAGATCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAG.在本发明中，步骤a中目的蛋白的核苷酸序列可以是任意可正常表达的功能蛋白的核苷酸序列，包括但不限于以下序列：流感病毒基质蛋白M2e的核苷酸序列、流感病毒核蛋白NP的核苷酸序列或卵清蛋白OVA的核苷酸序列等等。在本发明中，扩增表达全长的HBcAg的氨基酸序列，其长度为185aa，具体的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示：MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC.在本发明中，HBcAg衍生物不仅仅限于上述所列举的蛋白，任何可以插入到HBcAg序列中正常表达的功能蛋白，均适用于本发明。在本发明中，一般是将编码外源肽段的HBcAg衍生物的基因序列克隆到HBcAg基因序列的氮端、碳端或者MIR区域进行构建以及后续的转化表达。优选地，步骤2和步骤b中转入大肠杆菌表达系统的方法均为热转化法或电转化法。优选地，步骤2和步骤b中所述IPTG的浓度均各自独立地为0.1mmolL～1mmolL，例如可以是0.1mmolL、0.2mmolL、0.3mmolL、0.4mmolL、0.5mmolL、0.6mmolL、0.7mmolL、0.8mmolL、0.9mmolL或1mmolL等。在本发明中，通过适宜浓度的IPTG诱导后，目的蛋白即可正确组装成为病毒样颗粒。优选地，步骤2和步骤b中所述破碎菌体的缓冲溶液为醋酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液中的任意一种。优选地，所述缓冲溶液的pH值为5.0-9.0，例如可以是5.0、5.5、6.2、6.9、7.5、7.9、8.1、8.3、8.9或9.0等等。优选地，所述疏水作用层析填料为表面具有疏水基团的填料。优选地，所述疏水基团为丁硫基Butyl-S、丁基Butyl、辛基Octyl或苯基Phenyl中的任意一种。优选地，所述疏水基团为丁硫基或丁基。优选丁硫基或者丁基作为疏水基团，此时，可与HBcAg-VLP或HBcAg-VLP衍生物的疏水相互作用力强度适宜，VLP可以在高盐浓度下结合，低盐浓度下洗脱，获得更高的收率和纯度。在本发明中，以疏水作用层析作为工具，通过HBc-VLP表面的疏水区域与疏水层析填料上的疏水基团之间的相互作用，实现病毒样颗粒的吸附，从而与破碎上清液中不发生吸附和吸附较弱的杂质分开，采用温和的洗脱条件就可以把吸附在层析柱上的病毒样颗粒洗脱下来，达到提纯的目的。而现有的例如亲和层析等方法，载体昂贵，耐受性较差，应用非常局限。优选地，所述处理的方式包括：将上样液直接与疏水作用层析填料混合进行吸附或者将上样液加入到装有疏水作用层析填料的层析柱中进行层析和洗脱。在本发明中，上样液直接与疏水作用层析填料混合后，可进行静态的吸附过程，直接将病毒样颗粒吸附填料上，达到与其他杂质分离的目的；或者通过柱层析的方法，按照色谱法的常规操作平衡、上样、淋洗、洗脱以及填料的再生等步骤，将病毒样颗粒进行洗脱收集。优选地，所述含有HBcAg-VLP的上样液或HBcAg-VLP衍生物的上样液使用疏水作用层析填料处理前，对上样液进行预处理。优选地，所述预处理的方法为将上样液依次进行加热、使用无机盐调节电导。优选地，加热的温度为30℃～90℃，例如可以是30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃等。优选地，所述加热的时间为10min～300min，例如可以是10min、50min、60min、80min、90min、100min、150min、200min、250min或300min等。在本发明中，通过加热处理后的上样液，可以除去热不稳定的宿主蛋白，为达到初步纯化的效果。如果不采用加热处理时，则最终HBcAg-VLP及其衍生物的收率、纯度都会下降。优选地，所述无机盐包括硫酸铵、氯化钠、硫酸钠、氯化钠、氯化铵、磷酸钾、磷酸钠、磷酸二氢钠或磷酸氢二钠中的任意一种或至少两种的组合，优选为硫酸铵。优选地，所述调节电导为将电导调节至5mScm～300mScm，例如可以是5mScm、10mScm、50mScm、100mScm、150mScm、200mScm、250mScm或300mScm等，优选为50mScm～130mScm。优选地，当使用柱层析法纯化HBcAg-VLP及其衍生物时，所述洗脱的洗脱液电导为2mScm～130mScm，例如可以是2mScm、10mScm、30mScm、50mScm、60mScm、70mScm、80mScm、100mScm、120mScm或130mScm等。优选地，所述洗脱的洗脱液pH值为5.0～9.0，例如可以是5.0、6.0、7.0、8.0、9.0等。优选地，使用疏水作用层析填料处理后，还包括通过凝胶过滤层析进一步精制上样液，得到所述纯化的HBcAg-VLP或纯化的HBcAg-VLP衍生物。相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：1本发明提供的纯化方法，充分利用HBcAg-VLP稳定性好以及疏水性强的特性，采用疏水层析，保证HBcAg-VLP完整颗粒结构的前提下，将HBcAg-VLP以及其衍生物吸附在层析柱或层析填料上，与其他杂质进行分离，达到提纯制备的目的。本发明的纯化方法在不使用凝胶过滤的精制方法处理时，收率最高可达到90％以上，纯度最高可达到86％左右，相比于目前采用离子交换层析法存在的收率低、纯度较低的问题，本发明大大提升了纯化效果，如果辅以进一步的凝胶过滤等精制纯化的方法，其纯度可达到99％以上。2本发明提供的纯化方法，操作步骤少，仅仅需要一步疏水层析即可实现纯化；时间短，收率高，工艺稳定，重复性好，易于放大与工业化规模生产，具有较大的实际应用价值和推广前景。3本发明提供的纯化方法，为HBcAg-VLP以及其衍生物、相似类型的产品提供了一种新的纯化策略，为相关产品的生产提供了一种具有通用性的生产平台，大大拓展了HBcAg-VLP及其衍生物的应用范围，具有较高的经济价值和社会效益。附图说明图1是本发明实施例3中HBc-VLP表面疏水区域的结构图。图2是本发明实施例3中疏水层析纯化HBc-VLP的色谱图。图3是本发明实施例4中凝胶过滤法进一步纯化HBc-VLP的色谱图。图4是本发明实施例5中通过SDS-PAGE表征HBc-VLP的电泳图，其中M为marker，1为HBc-VLP细胞破碎后的上样液泳道，2为60℃热处理30min后上样液泳道，3为疏水层析后的洗脱液泳道，4为凝胶过滤后的HBc-VLP纯品泳道。图5是本发明实施例5中HBc-VLP纯品的高效液相检测以及多角度检测分子量图。图6是本发明实施例5中HBc-VLP的DLS粒径检测图标尺100nm。图7是本发明实施例5中HBc-VLP的透射电镜图。图8是本发明实施例6-8提供的HBc-VLP衍生物的SDS-PAGE检测图，其中M为marker，1和2分别为实施例7中制备的HBc-NPVLP破碎后的上样液泳道和纯化后的纯品泳道，3和4分别为实施例6中制备的HBc-M2eVLP破碎后的上样液泳道和纯化后的纯品泳道，5和6分别为实施例8中制备的HBc-OVAVLP破碎后的上样液泳道和纯化后的纯品泳道。具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。在本发明以下实施例中，大肠杆菌BL21DE3购自生工生物工程上海股份有限公司：离子交换填料和疏水填料均可从市面直接购买得到，既可以是在层析柱中预装填好的，也可以是自行将填料装填至层析柱中。实施例1本实施例通过以下制备HBcAg-VLP的上样液以及进行上样液的预处理质粒构建与转化：采用全长的乙肝核心抗原的核苷酸序列，SEQIDNO.1:ATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGCTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCTGCTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTTGCCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGGGACCGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGCAGATCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAG.其氨基酸序列SEQIDNO.2：MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC.通过PCR扩增，将扩增出的序列克隆至质粒pET21a中，获得重组质粒pET21a-HBc并转入大肠杆菌BL21DE3表达系统。菌种活化：使用LB固体培养基：蛋白胨10gL，酵母粉5gL，氯化钠10gL，琼脂15gL。灭菌后，冷却至低于50℃，加入氨苄青霉素至终浓度为100μgmL，将大约25mL培养基倒入无菌的培养皿中放置冷却。用涂布棒将少量的菌液转入质粒后的菌液在凝固后的平板表面涂布，然后在培养箱中37℃下培养直至长出单菌落一般12h即可。一级扩增培养：从平板上用无菌牙签挑选一株单菌落，加入到含50mLLB液体培养基的菌锥形瓶中，37℃下200rpm下培养12小时，获得活化扩增后的工程菌菌液。二级扩增培养：按1％的接种量加入到含500mLLB培养基的菌锥形瓶中，37℃下200rpm扩增培养培养至OD600达到0.5-1.0。目的蛋白诱导表达：用终浓度0.1mM的IPTG进行诱导，37℃下200rpm继续培养3.5h。菌体的收集与破碎：发酵液经Hitachi高速离心机4℃，4000rpm离心30min后收集菌体。按照质量体积比1:10的比例即1g湿菌体重悬于10mL破碎液将菌体重悬于破碎缓冲液20mMTris-HCl，pH7.9中，冰浴超声破碎菌体。超声功率为300W，超声2s后停3s，超声时间为60min。10000rpm，4℃离心菌体破碎液30min后弃去细胞碎片等沉淀，得到HBcAg-VLP的上样液。预处理：将HBcAg-VLP的上样液采用加热的方法进行预处理，除去部分杂质，以提供更“纯净”的原料，提高后续层析填料的使用时间和效率。将上清液的pH调至7.4左右后，60℃热处理30min，加热过程中为确保加热均匀，边搅拌边加热，后用10000g的离心力离心15min收集上清，使用调节电导至65mScm。实施例2本实施例采用离子交换层析法纯化HBc-VLP本实施例所采用的填料包括常规的DEAESepharoseFF和QSepharoseFF阴离子交换填料，以及超大孔填料POROSHQ、POROS50D和POROSPI共5种。在5种离子交换填料的筛选中，原料均采用实施例1所制备得到的上清液，从pH以及洗脱条件等方面进行优化后，得到收率和最终纯度的结果，如下表1所示：表1从表1中可以看出离子交换层析效果最好的是POROS50D大孔阴离子交换填料，经过纯化之后，HBc-VLP的收率为69.64％，纯度为37.27％，效果等同甚至优于已经报导的基于离子交换的纯化方法。实施例3本实施例使用疏水作用层析填料纯化HBcAg-VLP的上样液鉴于HBc-VLP表面存在较强的疏水区域结构图如图1所示，疏水层析主要靠疏水相互作用力实现目的蛋白的吸附和解吸，作用力相较离子相互作用力更加温和。因此，以实施例1制备的上样液为原料，采用的疏水填料的配基主要包括Butyl-S、Butyl、Octyl以及Phenyl。相比较而言，Butyl-SSepharose6FF与ButylSepharose4FF两种疏水性相对弱的填料更加适合HBc-VLP的纯化。上样液使用氢氧化钠溶液调至pH为pH7.4左右后，进料到电导65mScm的含有硫酸铵的20mM磷酸缓冲液pH7.4平衡的Butyl-SSepharose6FF或ButylSepharose4FF的疏水层析柱GEHealthcare，15cm×1.6cmI.D.中，进料后经继续淋洗，然后使用电导为1mScm磷酸钠缓冲液pH7.4洗脱，收集洗脱峰，如图2所示。层析介质采用1.0M氢氧化钠溶液再生。具体的洗脱结果如表2所示：表2经过Butyl-SSepharose6FF纯化后，HBc-VLP的纯度为86.32％，收率为92.10％；ButylSepharose4FF纯化后，HBc-VLP的纯度为79.73％，收率为89.65％。OctylSepharose4FF与PhenylSepharose6FF两种填料，疏水性较强，与HBc-VLP的相互作用力会更强一些，因此较疏水性弱的Butyl以及Butyl-S相比，HBc-VLP的收率和纯度也更低一些。实施例4本实施例通过凝胶过滤法进一步纯化实施例3得到的HBc-VLP取5mL疏水层析洗脱液，进料到Superdex200凝胶过滤柱GEHealthcare，60cm×1.6cmI.D.，流速为1mlmin，流动相为含有0.15M氯化钠的20mM磷酸钠缓冲液，pH7.4。分别检测洗脱峰组分的目的蛋白浓度及总蛋白浓度洗脱峰如图3所示，最后得到纯度99.3％的HBc-VLP，所得抗原总收率为62.9％。实施例5本实施例进行颗粒表征通过SDS-PAGE将HBc-VLP进行表征。SDS-PAGE结果如图4所示单一的21kDa左右的目的条带，说明纯化的HBc-VLP达到了高纯度，但只能检测HBc-VLP的亚基，不能将HBc-VLP完整颗粒与已经解聚或聚集VLP区分开，因此需要采用HPSEC检测颗粒，HPSEC检测的图谱中如图5所示单个对称峰很好的说明了经过以疏水层析为核心纯化制备的HBc-VLP全部为正确组装的的HBc-VLP完整颗粒。同时，对纯品进行DLS图6所示与MALLS图5所示检测，发现HBc-VLP粒径27.14nm，分子量6289kDa，结合透射电镜TEM图7所示检测，其颗粒呈均一的球形结构，说明纯化后的HBc-VLP是正确组装的颗粒结构，而且在纯化过程中，颗粒结构没有遭到破坏。实施例6本实施例通过以下步骤纯化HBcAg-VLP衍生物HBc-M2eVLP将编码流感病毒基质蛋白M2e的序列插入到HBcAg的MIR区域，即第79aa与80aa之间，将编码HBc-M2eVLP的重组质粒转入大肠杆菌BL21DE3表达系统。菌种活化后进行培养，当OD600为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.3mmolL，进行目的蛋白的诱导表达，继续培养4h，离心收集菌体，超声破碎法破碎工程菌，离心后收集上清液。取200mL含HBc-M2eVLP的破碎上清，总蛋白浓度为5.75mgmL，正确组装的HBc-M2eVLP为400μgmL，首先采用60℃加热40min的预处理方法除去热不稳定的杂蛋白。离心后，在热处理的上清液中依次用硫酸铵和氢氧化钠溶液分别调至电导率和pH至70mScm和pH7.0左右后，进料到电导70mScm的含有硫酸铵的20mM磷酸缓冲液pH7.0平衡的Butyl-SSepharose6FF疏水层析柱GEHealthcare，15cm×1.6cmI.D.，进料后经继续淋洗，然后电导为3mScm磷酸钠缓冲液pH7.0洗脱，收集洗脱峰。层析介质采用1.0M氢氧化钠溶液再生。利用HPLC检测洗脱峰组分中正确组装的HBc-M2eVLP颗粒含量，用考马斯亮蓝染色法测定总蛋白浓度，最后得到HBc-M2eVLP的收率为92.3％，纯度为81.2％，并对所得纯化的样品进行SDS-PAGE检测和高效液相凝胶过滤色谱检测，表明纯化所得为完整的HBc-M2e病毒颗粒。为进一步得到更高纯度的乙肝核心抗原病毒样颗粒，取5mL疏水层析洗脱液，进料到Superdex200凝胶过滤柱GEHealthcare，60cm×1.6cmI.D.，流速为1mLmin，流动相为含有0.15M氯化钠的20mM磷酸钠缓冲液，pH值为7.0。分别检测洗脱峰组分的目的蛋白浓度及总蛋白浓度，最后得到纯度99％以上的乙肝核心抗原病毒样颗粒，所得抗原总收率为52％。实施例7本实施例通过以下步骤纯化HBcAg-VLP衍生物HBc-NPVLP将编码流感病毒核蛋白NP的序列插入到HBcAg的N端，获得重组质粒pET21a-HBc-NP转入大肠杆菌BL21DE3表达系统。经过含有100μgmL氨苄青霉素的LB培养基筛选，挑取成功转入质粒的单菌落扩大培养。取10μL菌液加入至600mLLB培养基中37℃，200rpm培养，OD600＝0.7时，加入IPTG至终浓度为1.0mM进行目的蛋白的诱导表达，3h后停止培养。4000g离心15min收集菌体。菌体以1:20重悬于20mMTris-HClpH＝8.0的缓冲液中，利用40％950W的功率，工作2s，停3s，共超声30min对菌体进行超声破碎。100mL超声破碎液通过离心去除细胞碎片，上清中蛋白浓度为4.95mgmL，HBc-NPVLP的颗粒浓度为380μgmL，70℃热处理15min，10000g离心20min，弃沉淀，上清用硫酸铵调节电导为100mScm，缓冲体系为20mMTris-HClpH＝8.0，进料到ButylSepharose4FF疏水层析柱GEHealthcare，15cm×1.6cmI.D.中，填料预先用含有硫酸铵硫的电导为100mScm的20mMTris-HClpH＝8.0缓冲液平衡，进料后淋洗，然后分别用含有硫酸铵的电导为56mScmTris-HCl缓冲液pH8.0进行梯度洗脱，收集洗脱峰。层析介质采用0.5M氢氧化钠溶液再生。分别检测洗脱峰组分的目的蛋白的浓度及总蛋白浓度，最后得到HBc-NPVLP的收率为89.3％，纯度为76.3％。为进一步得到更高纯度的HBc-NPVLP，取10mL疏水层析洗脱液，进料到SephacrylS-500凝胶过滤柱GEHealthcare，120cm×1.6cmI.D.，流速为1mLmin，流动相为含有0.15M氯化钠的20mMTris-HCl缓冲液pH8.0。分别检测洗脱峰组分的目的蛋白浓度及总蛋白浓度，最后得到HBc-NPVLP纯度98.9％，收率61.3％。实施例8本实施例通过以下步骤纯化HBcAg-VLP衍生物HBc-OVAVLP将编码卵清蛋白OVA的序列插入HBcAg的C端，获得重组质粒pET21a-HBc-OVA，转入大肠杆菌BL21DE3表达系统。工程菌经过扩增培养后，取10μL菌液加入到500mLLB培养基中培养，OD600＝0.9时，加入IPTG至终浓度为0.5mM，开始诱导表达，30℃培养10h后停止培养。6000g离心10min收集菌体，菌体重悬后用高压匀浆机进行破碎。破碎液经过离心去除细胞碎片。取300mL含HBc-OVAVLP的破碎上清，总蛋白浓度为4.52gL，HBc-OVAVLP为260μgmL。50℃加热100min预处理的上清液中依次用硫酸铵和氢氧化钠溶液分别调至电导率和pH至50mScm和pH7.2左右后，与预先用含有硫酸铵的磷酸钠缓冲液pH7.2，电导50mScm平衡过的Butyl疏水介质混合，150rpm搅拌吸附30min后，加至层析柱GEHealthcare，10cm×1.6cmI.D.，继续淋洗后，分别用硫酸铵调至电导为35mScm磷酸钠缓冲液pH7.2进行梯度洗脱，收集含HBc-OVAVLP的洗脱液。层析介质采用30wt％异丙醇再生。分别检测洗脱峰组分的目的蛋白的浓度及总蛋白浓度，最后得到乙肝核心抗原病毒样颗粒相对于细胞上清液的收率为72.36％，纯度为73.92％。为进一步得到更高纯度的HBc-OVAVLP，取10mL疏水层析洗脱液，进料到SephacrylS-400凝胶过滤柱GEHealthcare，60cm×2.6cmI.D.，流速为2mLmin，流动相为含有0.15M氯化钠的20mMPB缓冲液pH7.2。分别检测洗脱峰组分的目的蛋白浓度及总蛋白浓度，最后得到HBc-OVAVLP纯度99.3％，收率41.3％。HBc-M2eVLP、HBc-NPVLP和HBc-OVAVLP通过SDS-PAGE进行表征，如图8所示。从图8中可以看出，三种病毒样颗粒均达到了高纯度。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的HBcAg-VLP或HBcAg-VLP衍生物的纯化方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。SEQUENCELISTING110中国科学院过程工程研究所华兰生物工程股份有限公司120一种HBcAg-VLP或HBcAg-VLP衍生物的纯化方法1302018.9.201602170PatentInversion3.32101211558212DNA213人工合成4001atggacattgacccttataaagaatttggagctactgtggagttactctcgtttttgcct60tctgacttctttccttccgtcagagatctcctagacaccgcctcagctctgtatcgagaa120gccttagagtctcctgagcattgctcacctcaccatactgcactcaggcaagccattctc180tgctggggggaattgatgactctagctacctgggtgggtaataatttggaagatccagca240tccagggatctagtagtcaattatgttaatactaacatgggtttaaagatcaggcaacta300ttgtggtttcatatatcttgccttacttttggaagagagactgtacttgaatatttggtc360tctttcggagtgtggattcgcactcctccagcctatagaccaccaaatgcccctatctta420tcaacacttccggaaactactgttgttagacgacgggaccgaggcaggtcccctagaaga480agaactccctcgcctcgcagacgcagatctcaatcgccgcgtcgcagaagatctcaatct540cgggaatctcaatgttag5582102211185212PRT213人工合成4002MetAspIleAspProTyrLysGluPheGlyAlaThrValGluLeuLeu151015SerPheLeuProSerAspPhePheProSerValArgAspLeuLeuAsp202530ThrAlaSerAlaLeuTyrArgGluAlaLeuGluSerProGluHisCys354045SerProHisHisThrAlaLeuArgGlnAlaIleLeuCysTrpGlyGlu505560LeuMetThrLeuAlaThrTrpValGlyAsnAsnLeuGluAspProAla65707580SerArgAspLeuValValAsnTyrValAsnThrAsnMetGlyLeuLys859095IleArgGlnLeuLeuTrpPheHisIleSerCysLeuThrPheGlyArg100105110GluThrValLeuGluTyrLeuValSerPheGlyValTrpIleArgThr115120125ProProAlaTyrArgProProAsnAlaProIleLeuSerThrLeuPro130135140GluThrThrValValArgArgArgAspArgGlyArgSerProArgArg145150155160ArgThrProSerProArgArgArgArgSerGlnSerProArgArgArg165170175ArgSerGlnSerArgGluSerGlnCys180185

权利要求：1.一种HBcAg-VLP或HBcAg-VLP衍生物的纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将含有HBcAg-VLP的上样液或HBcAg-VLP衍生物的上样液使用疏水作用层析填料处理得到纯化的HBcAg-VLP或纯化的HBcAg-VLP衍生物。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述HBcAg-VLP的菌液由以下步骤制备得到：1PCR扩增表达全长的HBcAg的核苷酸序列，将扩增后的序列克隆至质粒pET21a中，获得重组质粒pET21a-HBcAg；2将重组质粒pET21a-HBcAg转入大肠杆菌表达系统，使用IPTG诱导表达后，破碎菌体，收集上清液得到所述HBcAg-VLP的上样液；优选地，所述HBcAg-VLP衍生物的菌液由以下步骤制备得到：aPCR扩增表达全长的HBcAg的核苷酸序列，将扩增后的序列克隆至质粒pET21a中，而后将目的蛋白的核苷酸序列插入到HBcAg的核苷酸序列中，获得重组质粒pET21a-HBcAg衍生物；b将重组质粒pET21a-HBcAg衍生物转入大肠杆菌表达系统，使用IPTG诱导表达后，破碎菌体，收集上清液得到所述HBcAg-VLP衍生物的上样液。3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤1中所述HBcAg的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.根据权利要求2或3所述的纯化方法，其特征在于，步骤2和步骤b中转入大肠杆菌表达系统的方法均为热转化法或电转化法；优选地，步骤2和步骤b中所述IPTG的浓度均各自独立地为0.1mmolL～1mmolL；优选地，步骤2和步骤b中所述破碎菌体的缓冲溶液为醋酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液中的任意一种；优选地，所述缓冲溶液的pH值为5.0-9.0。5.根据权利要求1-4中任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述疏水作用层析填料为表面具有疏水基团的填料；优选地，所述疏水基团为丁硫基、丁基、辛基或苯基中的任意一种；优选地，所述疏水基团为丁硫基或丁基。6.根据权利要求1-5中任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述处理的方式包括：将上样液直接与疏水作用层析填料混合进行吸附或者将上样液加入到装有疏水作用层析填料的层析柱中进行层析和洗脱。7.根据权利要求1-6中任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述含有HBcAg-VLP的上样液或HBcAg-VLP衍生物的上样液使用疏水作用层析填料处理前，对上样液进行预处理；优选地，所述预处理的方法为将上样液依次进行加热、使用无机盐调节电导。8.根据权利要求1-7中任一项所述的纯化方法，其特征在于，加热的温度为30℃～90℃；优选地，所述加热的时间为10min～300min；优选地，所述无机盐包括硫酸铵、氯化钠、硫酸钠、氯化钠、氯化铵、磷酸钾、磷酸钠、磷酸二氢钠或磷酸氢二钠中的任意一种或至少两种的组合，优选为硫酸铵；优选地，所述调节电导为将电导调节至5mScm～300mScm，优选为50mScm～130mScm。9.根据权利要求6的纯化方法，其特征在于，所述洗脱的洗脱液电导为2mScm～130mScm；优选地，所述洗脱的洗脱液pH值为5.0～9.0。10.根据权利要求1-9中任一项所述的纯化方法，其特征在于，使用疏水作用层析填料处理后，还包括通过凝胶过滤层析进一步精制上样液，得到所述纯化的HBcAg-VLP或纯化的HBcAg-VLP衍生物。

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