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申请/专利权人：卢英

摘要：本发明为一种联合检测sFlt‑1PLGF和HLA‑G预测先兆子痫的方法：血清标本采集：分别采集先兆子痫组孕妇和正常同孕周孕妇静脉血5‑10ml，所有标本均在4h内用低温离心机3000rpm离心10min，取血清分装于EP管中，‑80℃冰箱保存待测；包被：用0.05M PH9.0碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μgml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，冲洗3次；设置标准品孔和样本孔，洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；加酶标抗体；除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min；洗板；每孔加入底物A、B各50μL，测定各孔OD值。其检测特异性和灵敏度高。

主权项：1.一种用于预测先兆子痫标志物，其特征在于，该先兆子痫标志物为sFlt‑1PLGF和HLA‑G。

全文数据：一种联合检测sFIt-1PLGF和HLA-G检测先兆子痫的方法技术领域[0001]本发明涉及免疫检测领域，具体为一种联合检测sFlt-1PLGF和HLA-G检测先兆子痫的方法。背景技术[0002]先兆子痫是高血压、水肿和蛋白尿的综合征，在全部妊娠中占7-15%，并且是其母体发病和致死的主要原因。全世界每年至少造成20万名产妇死亡。先兆子痫的症状通常是在怀孕第20周后出现且通常是通过常规监测妇女的血压和尿液而监测出来的。然而这些监测方法并不能有效的诊断早期综合征，如果能够早期监测到先兆子痫，采取有效的治疗，就可减少被试者或发育中胎儿的危险。[0003]先兆子痫的发病机制目前尚未完全清楚，其病因可能涉及母体、胎盘和胎儿等多种因素，包括血管内皮损伤和功能障碍、血管活性物质失衡及滋养细胞侵袭异常等。[0004]子宫-胎盘缺血缺氧学说是目前较为公认的子痫前期发病机制之一，其中胎盘缺血学说更为重要。先兆子痫是常见的妊娠期合并症，随着孕周的增加，该病有逐渐加重的趋势，但在胎盘娩出后，其病情便迅速得到控制和缓解，提示子痫前期是一种胎盘源性疾病。另外，某些患妊娠滋养细胞疾病的患者也会表现子痫前期的症状，更有力的证明了其发病与胎盘滋养细胞有关。上述现象均提示子痫前期的病因是胎盘因素。因而在对于子痫前期发病机制的研究中，正逐渐倾向于将其视为一种胎盘源性疾病，目前认为，血管内皮细胞的损伤、胎盘缺血缺氧及胎盘浅着床是子痫前期发病的病理生理基础，而母儿免疫失衡及遗传背景变化将使易感性增加。上述胎盘及滋养细胞缺血学说认为子痫前期的关键发病机制是绒毛外滋养细胞在孕早期对螺旋动脉侵袭不足，导致子宫螺旋动脉的重塑过程发生障碍，致使胎盘缺血缺氧，某些细胞毒性因子异常分泌，进入母体后引起广泛的血管内皮细胞损伤。子痫前期所产生的高血压、蛋白尿及水肿表现均是母体血管内皮的功能障碍所致。因此目前临床上有关子痫前期的预测研究主要围绕血管内皮功能紊乱及滋养细胞浅着床的机制而展开。[0005]先兆子痫PE的两个阶段发病理论被普遍认同，第一阶段称为临床前期，是由于绒毛外滋养细胞浸润能力下降，导致子宫螺旋动脉血管重铸不良、胎盘浅着床、胎盘血流灌注不足，进而导致胎盘缺血缺氧，刺激产生大量的胎盘因子;第二阶段为临床症状期，胎盘缺血缺氧进行性加重，胎盘损伤及组织细胞坏死，导致机体抗氧化能力降低，氧化和抗氧化平衡失调，出现氧化应激反应，并产生大量的氧化中间产物，其与胎盘因子通过母体血液循环，使得PE的病理变化从子宫-胎盘局部发展到全身各系统，引起血管内皮细胞损伤、凝血功能障碍、血管活性物质失衡、脂代谢障碍等各种临床症状。[0006]先兆子痫对母胎的危害相对较大，但是目前一旦发现一般都是出现了临床症状，无法采取有效的措施。虽然目前缺乏针对子痫前期的预防和治疗方法，但是寻求可以检测该危及生命的妊娠疾病的发展或者有助于该疾病的检测的非侵入性生物标志物仍然是最重要的。血清学指标检测是目前检测子痫前期的重要方法之一。寻找较高特异性、敏感性的生物指标来早期预测子痫前期的发病风险成为摆在研究人员面前的新课题。[0007]现有技术主要在检测方法和标志物选择方面存在以下缺陷：[0008]先兆子痫的发病机制目前尚未完全清楚，其病因可能涉及母体、胎盘和胎儿等多种因素，包括血管内皮损伤和功能障碍、血管活性物质失衡及滋养细胞侵袭异常等。发病涉及因素较多，发病机制比较复杂，因此目前文献中报道的标志物也是比较多，比较混杂。[0009]由于其复杂的发病机制，目前文献中常用于检测的大多是单一标志物以及两种标志物进行联合检测，三种标志物的联合检测目前还不多见，并且报道所知，选择的标志物联合检测之后敏感性和特异性方面都有待进一步提高。在标志物的选择方面也存在代表性不强，选择单一等缺点。发明内容[0010]针对现有先兆子痫检测采用的标志物及其组合的检测灵敏度和特异性不高，本发明选取了及具有代表性的sFlt-1PLGF的比值和HLA-G进行联合检测，以提高检测先兆子痫的敏感性和特异性。[0011]本发明提供如下技术方案：一种用于检测先兆子痫标志物，该先兆子痫标志物为sFlt-1PLGF和HLA-G。[0012]本发明还提供另外一种技术方案:该方法包括以下步骤:所述用于预测先兆子痫标志物的血清水平检测均采用ELISA方法中的双抗体夹心法进行检测；[0013]统计学分析:采用SPSS19.0统计软件分析，检测结果均采用均数土标准差X土s表不。[0014]作为优选，所述统计分析分析先兆子痫组、正常妊娠组中三种血清标志物的水平；分析先兆子痫组、正常妊娠组中sFlt-1PLGF的比值水平;分析三种标志物单独检测和联合检测的灵敏性与特异性，以P85可作为一个理想的预测和判断预后的截断值。[0032]Levine等发现，发病前5周子痫前期患者血清中sFlt-Ι开始升高，在其调节因子包括血红素氧合酶I和抗血管紧张素II-I型受体吱声抗体的作用下，以及血管生成因子（如VEGF和PLGF与抗血管生成因子平衡失调的情况下，sFlt-Ι可在子痫前期临床症状凸显前几周就发生改变，表达增加。[0033]HLA-G:主要在人的胎盘组织中转录，表达于母胎界面绒毛膜外滋养细胞上，HLA-G蛋白产物以两种形式存在，即表达于细胞表面的膜结合型以及存在细胞内的胞浆可溶型，目前已经在外周血，羊水以及脐血等中发现sHLA-G的存在。并且血清中可溶性人类白细胞抗原G和胎盘的表达呈正相关，能够代表胎盘表达的波动。妊娠过程被认为是一种异体移植，带有父源HLA的胚胎直接接触到母体蜕膜，理应受到母体免疫系统识别，产生免疫应答而遭到母体的排斥，可事实相反，母体对胎儿形成免疫耐受，大多数胎儿在母体内安然生长，母体这种免疫调节机制十分复杂，与诸多因素有关，但首先认为母胎免疫耐受的产生和维持主要取决于胚胎来源的滋养细胞表达HLA-G及不提调节蛋白等分子。HLA-G通过杀伤细胞抑制受体NK细胞杀伤功能，以及母胎界面细胞因子及粘附分子特殊分布，使得胎儿这种自然同种移植物在免疫功能健全的母体内存货，直至足月分娩。[0034]研究发现先兆子痫患者中HLA-G的含量明显低于正常孕产妇，是预测先兆子痫的一个良好指标。[0035]本发明的优点：联合代表性的sFlt-1PLGF的比值和HLA-G进行检测，大大提高预测先兆子痫的敏感性和特异性。具体实施方式[0036]实施例1:选取2016年5月份到2017年3月份在本市人民医院就诊的60例子痫前期孕妇研究组），并选择同期60例健康体检的孕妇为对照组，均为单胎孕妇。其中对照组的年龄在23-30岁，平均27.8±1.6岁，孕周20-23周，平均20.1±1.7周。研究组年龄在22-29岁，平均26.5±1.5岁，孕周在21-25周，平均21.5±1.4周。孕妇年龄及孕周等一般资料对比均无明显差异P〇.05，具有可比性。各组既往均无原发性高血压、糖尿病、心脏病、肾病、甲状腺功能亢进症、肝炎及结核等急慢性病史。本次研究内容已获得本院医学伦理会审核通过，且120例孕妇均自愿签署知情同意书。[0037]实验仪器及试剂耗材：可溶性FMS样酪氨酸激酶IElisa试剂盒、胎盘生长因子Elisa试剂盒、HLA-GElisa试剂盒；酶标仪450nm;高精度加样器及枪头：0.5-10此、2-20此、20-2001^、200-1000此;37°：恒温箱。其中试剂盒均购买自上海名劲生物科技有限公司，酶标仪购买自北京科华生物ST360。[0038]实施步骤：（1血清标本采集:先兆子痫组孕妇入院后，采集肘静脉血5-10ml至采血管中，正常同孕周孕妇进行产前检查时采肘静脉5-10ml于另外的采血管中；收集血液后静止凝固，所有标本均在4h内用低温离心机3000rpm离心IOmin，取血清分装于EP管中，-80°：冰箱保存待测；[0039]⑵取出各试剂盒从室温平衡20min后的铝箱袋中取出所需板条；[0040]3包被：用0.05MPH9.0碳酸盐包被缓冲液将各自抗体稀释至蛋白质含量为1〜10ygml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.Iml，4°C过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；[0041]⑷设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50yL;[0042]5将待测样本在-80°C取出，平衡至室温，样本孔先加待测样本10yL，再加样本稀释液40yL，置37tC孵育1小时，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；[0043]6加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体经滴定后的稀释度）0.Iml。37°C孵育0.5〜1小时，洗涤；[0044]7除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体IOOyL，用封板膜封住反应孔，37°C水浴锅或恒温箱温育60min;[0045]8弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置Imin，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次或者用洗板机洗板；[0046]9每孔加入底物A、B各50yL，37°C避光孵育15min;[0047]10每孔加入终止液50yL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。[0048]上述标志物抗体血清水平检测的实验步骤均严格按照试剂盒中说明书进行，大致实验步骤一致如下所示：[0049]值得注意的是各试剂盒的标准品浓度设置是有区别的，下面一一列出各试剂盒的原理以及检测步骤：[0050]sFlt-Ι试剂盒原理:本试剂盒采用[0051]标准品浓度依次为:0、25、50、100、200、400pgmL;样本稀释液:20X洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释，S卩1份的20X洗涤缓冲液加19份的蒸馏水;所有液体组分使用前充分摇勾。[0052]实验步骤严格按照试剂盒说明书中进行：[0053]1.加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液IOOyU余孔分别加标准品或待测样品l〇〇yL，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37°C反应90分钟；[0054]2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每空加生物素话抗体工作液100yL，37°C，60分钟；[0055]3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μ!7孔，甩干；[0056]4.每孔加酶结合底物IOOyL，37°C，60分钟；[0057]5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡I-2分钟，350μ!7孔，甩干；[0058]6.依序每孔加底物溶液90yL，37°C避光显色30分钟内）；[0059]7.依序每孔加终止液50yL，终止反应；[0060]8.用酶标仪在450nn处依序测量各孔的OD值，在加入终止液15分钟后测量。PLGF试剂盒原理：[0061]本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗人PLGF抗体包被于酶标板上，实验时赝品或标准品中的人PLGF会与包被抗体结合，游离成分被洗去。依次加入生物素化的抗人PLGF抗体和辣根过氧化物酶标记亲和素，抗人PLGF抗体与结合在包被抗体的人PLGF结合、生物素与亲和素特异性结合形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物TMB，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm处检测OD值，通过绘制标准曲线计算样本在PLGF的含量。[0062]标准品建议配置浓度为：1000，500，250，125，65·5，31·25，15·63，0pgml。[0063]实验步骤严格按照试剂盒说明书中进行：[0064]1.加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100yL，余孔分别加标准品或待测样品i〇〇yL，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37°C反应90分钟；[0065]2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每空加生物素话抗体工作液100yL，37°C，60分钟；[0066]3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μ!7孔，甩干；[0067]4.每孔加酶结合底物IOOyL，37°C，60分钟；[0068]5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡I-2分钟，350μ!7孔，甩干；[0069]6.依序每孔加底物溶液90yL，37°C避光显色30分钟内）；[0070]7.依序每孔加终止液50yL，终止反应；[0071]8.用酶标仪在450nn处依序测量各孔的OD值，在加入终止液15分钟后测量。[0072]HLA-G试剂盒原理:本试剂盒采用双抗体夹心Elisa法，用抗人HLA-G抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的人HLA-G会与包被抗体结合，游离成分被洗去。一次加入生物素化的抗人HLA-G抗体和辣根过氧化物酶标记亲和素。抗人HLA-G抗体与结合在包被板上人HLA-G结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物TMB，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色，用酶标仪测450nm0D值，绘制标准曲线计算样本中HLA-G浓度。[0073]标准品浓度为:80，40，20，10，5，2·5，1·25，0·63，Ongml[0074]实验步骤：[0075]1.将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔IOOyL。待测样品加入到其他孔，每孔IOOyL，给酶标板覆膜，37°C孵育90分钟；[0076]2.弃去液体，甩干，不用洗涤，每孔加入生物素化抗体工作液IOOyL，混匀，酶标板加上覆膜，37°C温育60分钟；[0077]3.甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350yL，弃去液体，拍干，重复三次；[0078]4.每孔加入酶结合工作液100yL，加上覆膜，37°C温育30分钟；[0079]5.弃去液体，甩干，洗板五次，方法同步骤3;[0080]6.每孔加90yL底物溶液TMB，酶标板加覆膜，37°C避光孵育15分钟；[0081]7.每孔加入终止液50yL，终止反应；[0082]8·用酶标仪检测450nm处OD值。[0083]检测数据计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。[0084]统计分析是采用SPSS19.0统计软件分析，检测结果均采用均数土标准差X土s表示，分析两组中三种血清标志物的水平；分析两株中sFlt-1PLGF的比值水平;分析三种标志物单独检测和联合检测的灵敏性与特异性，以P85即可判断是先兆子痫。[0094]表3先兆子痫组血清sFlt-1PLGF比值与HLA-G特异性敏感性分析[0095][0097]结果分析:通过我们对60例的先兆子痫孕产妇和正常妊娠孕妇进行分析，优选在20-25周分别抽取7.5ml血液进行处理，按照前述的实验步骤进行处理，结果发现有60例先兆子痫患者的sFlt-Ι明显高于对照组、PLGF和HLA-G的含量明显低于对照组，差异具有统计学意义，继续分析，单独检测sFlt-Ι敏感性为79.2%，特异性为73.6;PLGF敏感性为74.3%，特异性为77.2%;sFlt-1PLGF敏感性85.8%，特异性88.6%，由此得出两者比值检测先兆子痫的敏感性和特异性大于单个指标单独检测。HLA-G敏感性为89.3%，特异性为85.9%;8卩1卜1外1^^、!11^-6联合敏感性为98.5%，特异性为95%。分析得知8?1丨-1与？1^^比值和HLA-G联合检测的灵敏性和特异性均高于单个指标，因此联合检测优于单独检测。

权利要求：1.一种用于预测先兆子痫标志物，其特征在于，该先兆子痫标志物为sFlt-1PLGF和HLA-G02.—种联合检测sFlt-1PLGF和HLA-G预测先兆子痫的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:所述标志物的血清水平检测均采用ELISA方法中的双抗体夹心法进行检测；统计学分析:采用SPSS19.0统计软件分析，检测结果均采用均数土标准差X±s表示。3.根据权利要求2所述的联合检测sFlt-1PLGF和HLA-G预测先兆子痫的方法，其特征在于，所述统计分析分析先兆子痫组、正常妊娠组中三种血清标志物的水平;分析先兆子痫组、正常妊娠组中sFlt-1PLGF的比值水平;分析三种标志物单独检测和联合检测的灵敏性与特异性，以P〇.05为差异有统计学意义。4.根据权利要求2所述的联合检测sFlt-1PLGF和HLA-G预测先兆子痫的方法，其特征在于，所述ELISA双抗体夹心法进行血清水平检测的实验步骤为：1血清标本采集:先兆子痫组孕妇入院后，采集肘静脉血5-10ml至采血管中，正常同孕周孕妇进行产前检查时采肘静脉5-10ml于另外的采血管中；收集血液后，所有标本均在4h内用低温离心机3000rpm离心lOmin，取血清分装于EP管中，-80°C冰箱保存待测；⑵取出各试剂盒从室温平衡20min后的铝箱袋中取出所需板条；⑶包被：用〇.05MPH9.0碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1〜lOygml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4°C过夜，次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；⑷设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50yL;⑸将待测样本在_80°C取出，平衡至室温，样本孔先加待测样本10yL，再加样本稀释液40yL，置37tC孵育1小时，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；⑹加酶标抗体:于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体经滴定后的稀释度〇.Iml，37°C孵育0.5〜1小时，洗涤；7除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体ΙΟΟμL，用封板膜封住反应孔，37°C水浴锅或恒温箱温育60min;⑻弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置Imin，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次或者用洗板机洗板；⑼每孔加入底物A、B各50yL，37°C避光孵育15min;10每孔加入终止液50yL，15min内，在450nm波长处测定各孔的㈤值。

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