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申请/专利权人：河南师范大学

摘要：本发明公开了一种增强嗜水气单胞菌OmpA疫苗接种效果的小分子代谢物佐剂及其应用，属于免疫佐剂技术领域。本发明的技术方案要点为：一种增强嗜水气单胞菌OmpA疫苗接种效果的小分子代谢物佐剂，该小分子代谢物佐剂为精氨酸或和半胱氨酸。本发明还具体公开了该小分子代谢物佐剂作为嗜水气单胞菌OmpA疫苗增效剂的应用。本发明的小分子代谢物佐剂可以有效提高嗜水气单胞菌OmpA疫苗接种后的免疫效果，进而提高鱼体抗病能力。

主权项：1.一种增强嗜水气单胞菌OmpA疫苗接种效果的小分子代谢物佐剂，其特征在于：该小分子代谢物佐剂为精氨酸或和半胱氨酸，两者质量百分比为0%‑100%。

全文数据：一种增强嗜水气单胞菌OmpA疫苗接种效果的小分子代谢物佐剂及其应用技术领域本发明属于免疫佐剂技术领域，具体涉及一种增强嗜水气单胞菌OmpA疫苗接种效果的小分子代谢物佐剂及其应用。背景技术水产动物病害一直是水产养殖业中不可忽视的问题。近年来，随着绿色健康养殖逐渐变成主流，免疫防病作为解决病害的一个重要途径，因其不仅可防控重要疾病的发生，还可以避免药物滥用引起的药物残留和环境污染的特点得到了越来越多的关注，可以预见免疫防病在鱼类疾病防控中具有较大潜力和应用前景。随着生物工程技术的迅猛发展，蛋白质亚蛋白疫苗，DNA疫苗得到深入研究，其中，细菌OmpA蛋白在疫苗领域得到重视。细菌OmpA蛋白是革兰氏阴性菌的主要外膜蛋白之一，具有维持细菌外膜结构完整性与稳定性的作用，在细菌对宿主粘附、侵袭过程中起着重要的作用，它能够刺激树突状细胞分泌相关细胞因子，同时还能诱导树突状细胞向感染区域迁移。研究表明，OmpA家族蛋白是一类具有高度免疫原性的蛋白，可作为疫苗研发的候选靶分子，在水产养殖疫苗的研发与应用中，OmpA亚单位疫苗均表现出较高的免疫保护作用，不仅能够刺激体液免疫还可以刺激细胞免疫，其诱导产生的免疫力对其它血清型的嗜水气单胞菌有交叉保护的作用。多年来，疫苗佐剂的研究不断深入，目前效果和应用前途得到学者们认可的佐剂有：传统免疫佐剂如铝盐佐剂、油乳佐剂、弗氏佐剂等；细胞因子佐剂如白细胞介素-2、干扰素等；天然来源佐剂如多糖佐剂、蜂胶佐剂、皂甙佐剂、黄酮佐剂等；新型免疫佐剂如免疫刺激复合物佐剂、CpGODN佐剂、脂质体佐剂、纳米佐剂等。但是在佐剂大量出现的同时，随之而来的是对其安全性的担忧。最新的研究表明，小分子代谢物作为一种新型的免疫佐剂，同时具有高效性和安全性的优势，是一种具有较好研究前景的疫苗佐剂。本发明在现有疫苗佐剂研究的基础上，发现精氨酸和半胱氨酸作为候选的小分子代谢物佐剂，对嗜水气单胞菌OmpA亚单位疫苗的免疫保护作用具有显著的提高。而精氨酸和半胱氨酸是鱼类生长的必需氨基酸，具有营养和免疫的双重功能，其作为疫苗佐剂具有无任何毒副作用，制作简单，操作方便，适合规模化应用的优势。然而，目前尚没有该方面的相关报道。发明内容本发明解决的技术问题是提供了一种增强嗜水气单胞菌OmpA疫苗接种效果的小分子代谢物佐剂及其应用，该小分子代谢物佐剂可以有效提高嗜水气单胞菌OmpA疫苗接种后的免疫效果，进而提高鱼体抗病能力。本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种增强嗜水气单胞菌OmpA疫苗接种效果的小分子代谢物佐剂，其特征在于：该小分子代谢物佐剂为精氨酸或和半胱氨酸，两者质量百分比为0％-100％。进一步优选，所述嗜水气单胞菌OmpA疫苗为OmpA亚单位疫苗或OmpADNA疫苗。本发明所述的小分子代谢物佐剂作为嗜水气单胞菌OmpA疫苗增效剂的应用。进一步优选，所述小分子代谢物佐剂作为嗜水气单胞菌OmpA疫苗增效剂用于增强疫苗接种后的效果，进而提高鱼体抵抗病原菌感染的能力。进一步优选，所述小分子代谢物佐剂作为嗜水气单胞菌OmpA疫苗增效剂用于增强OmpA蛋白抗原的免疫原性，进而提高鱼体免疫后特异性抗体的滴度，使鱼体获得更好的免疫保护效果。进一步优选，所述小分子代谢物佐剂作为嗜水气单胞菌OmpA疫苗增效剂用于增强鱼体肝脏组织中IgM基因、TNFα基因、c-型溶菌酶、g-型溶菌酶和IL-1β基因对接种嗜水气单胞菌OmpA疫苗的免疫应答反应，进而提高宿主对外界病原菌的抗感染能力。进一步优选，所述小分子代谢物佐剂与嗜水气单胞菌OmpA疫苗混合使用，或者所述小分子代谢物佐剂与嗜水气单胞菌OmpA疫苗分开使用，其中小分子代谢物佐剂与嗜水气单胞菌OmpA疫苗的质量比为1-1000:1，或者所述小分子代谢物佐剂进行拌饲投喂，该小分子代谢物佐剂占饲料的重量百分比为0.1％-5％，与嗜水气单胞菌OmpA疫苗不同时使用。本发明与现有技术相比具有以下优点：1、本发明在一定程度上减少了嗜水气单胞菌OmpA疫苗的使用量，降低了生产成本；2、与现有市面上的免疫佐剂相比，作为一种天然小分子物质，本发明提供的免疫佐剂无任何毒副作用，减少了对鱼体和养殖水环境的影响，是一种绿色健康的免疫防治方法；3、本发明的免疫佐剂具有制作简单，操作方便等优点，因而具有良好的应用前景和市场推广价值。附图说明图1是黄河鲤免疫接种OmpA亚单位疫苗及小分子代谢物佐剂后的免疫效果评价；图2是ELISA分析OmpA特异性抗体滴度；图3是黄河鲤免疫接种OmpA亚单位疫苗及小分子代谢物佐剂后肝脏组织中IgM基因、TNFα基因、c-型溶菌酶、g-型溶菌酶和IL-1β基因的相对表达量。具体实施方式以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。实施例1精氨酸和半胱氨酸增强OmpA亚单位疫苗的免疫保护效果黄河鲤免疫接种OmpA亚单位疫苗：选取规格一致，健康的黄河鲤50±5g，随机分为5组，每组20尾。每尾鱼腹腔注射50μg蛋白溶于100μLPBS缓冲液中，佐剂组将蛋白与1mg尾剂量的精氨酸或和半胱氨酸混合，对照组注射100μLPBS缓冲液，注射疫苗后的鱼继续置于25℃恒温水箱中饲养28天。疫苗后细菌攻毒：嗜水气单胞菌在平板上培养16h，挑取单菌落到新的LB培养基中，180rmin过夜培养，用生理盐水调OD600＝0.6约5×108CFUmL。免疫28天后，每尾注射0.1mL5×107CFUmL的嗜水气单胞菌菌液进行攻毒，注射后的鱼置于25℃水箱中，连续观察7天，每天记录鱼的发病和死亡情况，最后统计累计死亡率。免疫保护率＝[1–免疫组死亡率对照组死亡率]×100％。如图1所述，对照组试验鱼的的累积死亡率为95％，OmpA亚单位疫苗免疫后试验鱼的累积死亡率为60％，经计算其免疫保护率为37％。在三个佐剂组中，1mg尾剂量的精氨酸或半胱氨酸与OmpA亚单位疫苗混合免疫后，试验鱼的累积死亡率显著下降，特别是两种小分子代谢物联合应用时，试验鱼的累积死亡率为10％，即免疫保护率为89.5％，明显高于单独使用OmpA亚单位疫苗的免疫保护率。由此可见，该小分子代谢物佐剂能够有效的促进OmpA亚单位疫苗的免疫保护作用，进而提高黄河鲤抵抗嗜水气单胞菌侵染的能力。实施例2小分子代谢物佐剂增强疫苗接种后抗体滴度抗OmpA特异性抗体滴度检测：将OmpA蛋白抗原包被在ELISA板中，取实施例1中免疫接种28天的鱼体血清，每组取3尾鱼的血清混合进行抗体滴度检测。所得血清用PBS稀释按1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640共7个梯度稀释，每孔加样为50μL。抗原与抗体孵育1h后，用PBS缓冲液清洗3遍，再加入1:2000稀释的碱性磷酸酶标记兔抗鱼IgM抗体作为二抗。100μL显色液，5min后再加入50μL1MH2SO4终止反应，ELISA板用酶标仪在450nm波长读数，所得结果用Excel软件作图。酶联免疫法分析结果见图2，对照组只有本底的吸光度，表明没有特异性抗体产生。OmpA蛋白抗原单独免疫28天后，抗血清按1:10稀释时吸光度为0.6，其抗体滴度为1:80。精氨酸或半胱氨酸与OmpA亚单位疫苗混合免疫后，ELISA方法检测到更高的吸光度，特别是精氨酸与半胱氨酸联合作为小分子代谢物佐剂免疫时，鱼体抗1:10稀释时吸光度达0.92，其抗体滴度至少为1:640，与不加佐剂组相比较，其抗体滴度至少提高8倍。这说明小分子代谢物佐剂能增强OmpA蛋白抗原的免疫原性，使鱼体获得更好的免疫保护效果。实施例3小分子代谢物佐剂增强鱼体对嗜水气单胞菌OmpA疫苗的免疫应答RNA提取与反转录：mah-pcDNA3.1疫苗疫苗28天后，每组取3尾鱼的肝脏组织用于RNA提取。按照Trizol法提取鱼体总RNA，加入DNaseI，37℃消化1h以去除基因组DNA污染，再用随机引物进行反转录，以反转录产物为模板进行荧光定量检测。qRT-PCR检测鱼体中免疫相关基因的表达：荧光定量RT-PCR的方法检测IgM、TNFα、c-型溶菌酶、g-型溶菌酶和IL-1β共5个基因的表达水平，以β-actin基因为内参。特异性引物分别为：IgM-F：5’GCGCGTGAGGAAAAGTGATT3’，IgM-R：5’GAAAACCGCTGGGCTAAACA3’；TNFα-F：5’GAAGTCCGGCTCGTCAAAGT3’，TNFα-R：5’GATGGCTGCCTTGGAAGTGA3’；c-型溶菌酶-F：5’GGCACTCCAGGTGGAAAGAA3’，c-型溶菌酶-R：5’AGTAACTTCCCCAGGTATCCCA3’；g-型溶菌酶-F：5’GAATGGGTGGGAACCCGTAG3’，g-型溶菌酶-R：5’CATTGGGCTCTGGCAACAAC3’；IL-1β-F：5’AGCTGTCTTCGCATCCTCAC3’，IL-1β-R：5’CGAGCAGCTCCTCATCACAA3’；β-actin-F：5’GAGTGATGGTTGGCATGGGA3’，β-actin-R：5’CCCAGTTGGTCACAATACCGT3’。结果显示，OmpA亚单位疫苗免疫后，IgM、TNFα和g-型溶菌酶等免疫基因的表达量显著增加P河南师范大学一种增强嗜水气单胞菌OmpA疫苗接种效果的小分子代谢物佐剂及其应用201814SIPOSequenceListing1.0120DNA人工序列artificialsequence1gcgcgtgaggaaaagtgatt20220DNA人工序列artificialsequence2gaaaaccgctgggctaaaca20320DNA人工序列artificialsequence3gaagtccggctcgtcaaagt20420DNA人工序列artificialsequence4gatggctgccttggaagtga20520DNA人工序列artificialsequence5ggcactccaggtggaaagaa20622DNA人工序列artificialsequence6agtaacttccccaggtatccca22720DNA人工序列artificialsequence7gaatgggtgggaacccgtag20820DNA人工序列artificialsequence8cattgggctctggcaacaac20920DNA人工序列artificialsequence9agctgtcttcgcatcctcac201020DNA人工序列artificialsequence10cgagcagctcctcatcacaa201120DNA人工序列artificialsequence11gagtgatggttggcatggga201221DNA人工序列artificialsequence12cccagttggtcacaataccgt211329DNA人工序列artificialsequence13cgcggatccatgacatctacttcggtgcc291429DNA人工序列artificialsequence14cccaagcttacttcttgtacgccggatac29

权利要求：1.一种增强嗜水气单胞菌OmpA疫苗接种效果的小分子代谢物佐剂，其特征在于：该小分子代谢物佐剂为精氨酸或和半胱氨酸，两者质量百分比为0%-100%。2.根据权利要求1所述的增强嗜水气单胞菌OmpA疫苗接种效果的小分子代谢物佐剂，其特征在于：所述嗜水气单胞菌OmpA疫苗为OmpA亚单位疫苗或OmpADNA疫苗。3.权利要求1或2所述的小分子代谢物佐剂作为嗜水气单胞菌OmpA疫苗增效剂的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述小分子代谢物佐剂作为嗜水气单胞菌OmpA疫苗增效剂用于增强疫苗接种后的效果，进而提高鱼体抵抗病原菌感染的能力。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述小分子代谢物佐剂作为嗜水气单胞菌OmpA疫苗增效剂用于增强OmpA蛋白抗原的免疫原性，进而提高鱼体免疫后特异性抗体的滴度，使鱼体获得更好的免疫保护效果。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述小分子代谢物佐剂作为嗜水气单胞菌OmpA疫苗增效剂用于增强鱼体肝脏组织中IgM基因、TNFα基因、c-型溶菌酶、g-型溶菌酶和IL-1β基因对接种嗜水气单胞菌OmpA疫苗的免疫应答反应，进而提高宿主对外界病原菌的抗感染能力。7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述小分子代谢物佐剂与嗜水气单胞菌OmpA疫苗混合使用，或者所述小分子代谢物佐剂与嗜水气单胞菌OmpA疫苗分开使用，其中小分子代谢物佐剂与嗜水气单胞菌OmpA疫苗的质量比为1-1000:1，或者所述小分子代谢物佐剂进行拌饲投喂，该小分子代谢物佐剂占饲料的重量百分比为0.1%-5%，与嗜水气单胞菌OmpA疫苗不同时使用。

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