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摘要：本发明涉及桃生长素原初响应因子基因PpIAA1及其应用。从桃果实中克隆得到PpIAA1基因，进一步将上述PpIAA1基因稳定转化Micro‑Tom番茄进行功能验证。结果表明，和野生型番茄相比，PpIAA1转基因株系植株根系分支减少、叶片颜色明显变绿、果实提前成熟和货架期变短。同时转PpIAA1基因株系的番茄果实成熟期提前6～8天。通过1‑MCP处理‘中油桃13号’能明显抑制基因PpIAA1表达，NAA或乙烯处理‘中油桃16号’能显著促进基因PpIAA1表达，说明该基因在桃果实成熟软化过程中起重要作用。本发明筛选的PpIAA1基因将有助于研究在桃果实成熟期生长素和乙烯共同促进桃果实成熟的响应机制。

主权项：1.桃生长素原初响应因子PpIAA1基因在减少番茄侧根数目和或加深番茄叶片颜色中的应用，其特征在于，所述PpIAA1基因序列如SEQ ID NO:1所示。

全文数据：桃生长素原初响应因子PpIAA1基因及其应用技术领域本发明属于生长素应答因子基因及其应用领域，具体涉及桃生长素原初响应因子PpIAA1基因及其应用。背景技术桃[PrunuspersicaL.Batsch]果实一般为溶质型（meltingflesh，MF），属于呼吸跃变型果实，在乙烯跃变后迅速软化，达到商品成熟，而硬质型桃果实成熟期（stonyhard，SH）没有乙烯跃变高峰，果实不变软。Tatsuki等（Tatsukietal.,2013）比较溶质型和硬质型桃成熟期果实发现，两者间不仅乙烯释放量存在差异，同时生长素和脱落酸积累也存在明显的差异，且硬质型桃乙烯合成水平较低可能是由于其生长素（IAA）的水平较低。采用生长调节剂萘乙酸（1-Naphthaleneaceticacid，NAA）处理硬质桃果实可以诱导ACS1表达迅速提升，从而产生大量乙烯，果实变软。生长素在果实发育的各个阶段均起重要的调节作用。生长素在转录水平上的调控作用受到诸多蛋白的影响。生长素吲哚乙酸蛋白（auxinindoleaceticacidsprotein，AuxIAA）和生长素反应因子（auxinresponsefactor，ARF）是两类重要的调控蛋白。生长素通过对AuxIAA（auxinindole-3-aceticacid）蛋白水平的调节进而快速诱导一系列的生长素响应基因表达。AuxIAA家族的基因属于生长素原初反应基因，编码半衰期较短的核定位蛋白质。大量研究表明这些核定位蛋白可以通过与生长素响应因子ARF形成异源二聚体而在生长素信号传导过程中起到抑制的作用。在果实发育的各个阶段AuxIAA家族基因均起着十分重要的作用。在番茄中，沉默SlIAA9基因会引起番茄的单性结实，同时番茄叶片由单叶变为复叶。沉默SlIAA27基因引起了番茄的单性结实，并且改变了果实的大小和形状。近来研究发现，沉默番茄SlIAA17基因后转基因植株果实细胞明显增大，果皮增厚，果实变大，同时果实可溶性固形物、pH值、硬度均发生改变。而桃果实中PpIAA1基因的研究却鲜有报道。发明内容本发明的目的之一是提供桃生长素原初响应因子PpIAA1基因在减少番茄侧根数目和或加深番茄叶片颜色中的应用。本发明的目的之二是提供桃生长素原初响应因子PpIAA1基因在促进番茄果实成熟和或减少番茄果实储藏时间中的应用。桃生长素原初响应因子PpIAA1基因序列如SEQIDNO:1所示。进一步地，桃生长素原初响应因子PpIAA1基因所编码的蛋白如SEQIDNO:2所示。本发明还提供含有桃生长素原初响应因子PpIAA1基因的重组植物表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。为达到以上目的，所采取的技术方案为：从桃果实中提取RNA，通过反转录试剂盒（天根，北京）获得单链cDNA，以单链cDNA为模板，以下述序列为引物，通过PCR获得PpIAA1基因的全长序列。引物序列为：正向IAA1f：5'-ATGAACATGCCACCGGATGCTG-3'，如SEQIDNO:3所示；反向IAA1r：5'-TTGTGGCAGAACCTGAGACGTC-3'，如SEQIDNO:4所示；退火温度为58℃。将目的片段通过pTOPO-blunt载体克隆，然后用一步克隆试剂盒连接到pK2GW7载体上。检测阳性克隆的引物序列分别为vIAA1f：5'-GGAGTCCACCATGGTAATGAACATGCCACCGGATGCTG-3'，如SEQIDNO:5所示；vIAA1r：5'-TAGCGTTAACACTAGTCATTGTGGCAGAACCTGAGACGTC-3'，如SEQIDNO:6所示。用1%琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，阳性克隆送至上海生工生物科技股份有限公司测序。鉴于桃尚未建立高效、成熟的遗传转化体系，故采用模式植物Micro-Tom番茄用PpIAA1基因的功能验证，番茄转化方法参照Sunetal（2006），BeeLynnChewandYuPan（诺丁汉大学）优化。Micro-Tom番茄种子用75%酒精表面消毒，无菌水漂洗3次后，10%次氯酸钠消毒1h。取出后在无菌水中清洗6次，滤纸上晾干。种子播种于pH5.9，含有0.8%琼脂的50%MS培养基中。植物在14h10h光暗，25℃，80%相对湿度、250μmolm-2s-1光强的组培室中培养。利用农杆菌介导的叶盘法将构建的含有PpIAA1基因的pK2GW7载体导入Micro-Tom番茄中，经过共培养、潮霉素筛选培养、生根培养等过程获得潮霉素抗性植株，结合抗生素筛选、PCR分子鉴定阳性植株，确保下一步转基因植株材料的准确性。PCR鉴定阳性植株所用的引物：pK2GW7F：5'-TTCTTGTTCCCATTTCTCTCT-3'，如SEQIDNO:7所示；pK2GW7R：5'-AGCTGGTCACCTGTAATTCAC-3'，如SEQIDNO:8所示，用于证实片段插入。本发明方法是克隆桃AuxIAA相关的基因家族成员，分析该基因在溶质型桃果实成熟过程中的表达模式，最后用农杆菌介导的方法转入Mcro-Tom番茄中验证目的基因的功能。有利于从分子机制上阐明在桃成熟过程中的生长素信号的响应机制，对进一步实现桃有目的、有针对性的品质和性状改良，创制桃新种质，具有积极的指导作用。本发明研究了PpIAA1基因在转基因番茄中的作用，以野生型为对照，测定了其在生长10d时植株根系，结果植株侧根数目明显少于野生型。观察植株性状发现，转基因株系的叶片颜色明显深于野生型株系；对番茄果实的观察发现，转基因成熟明显早于野生型，采后观察发现，转基因株系的果实储藏时间明显短于野生型，因此PpIAA1基因改变了番茄成熟及采后货架期。由此，将本发明PpIAA1基因基因引入到目标植物或植物细胞中，能够有效改变目标植物的营养生长和生殖生长能力。本发明还提供了一种培育转PpIAA1基因植物的方法，包括：1构建含有所述PpIAA1基因的重组植物表达载体；2将所构建的重组植物表达载体转化到植物细胞或植物组织中；3培育筛选得到转基因植物。相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明通过克隆桃生长素响应因子PpIAA1，分析该基因在溶质型桃果实成熟过程中的表达模式，采用酵母单杂交、烟草双荧光素酶和桃瞬时表达技术，揭示生长素可以通过PpIAA1直接调控乙烯合成关键基因PpACS1、脱落酸（ABA）合成关键基因PpNCED23以及细胞壁降解相关基因PpPG1。最后用农杆菌介导的方法转入Micro-Tom番茄中验证目的基因的功能，从分子机制上阐明在桃成熟过程中的生长素信号的作用机制，对进一步实现桃有目的、有针对性的品质和性状改良，培育桃新品种，具有积极的指导作用。附图说明图1为桃PpIAA1基因PCR扩增电泳图，M:DL2000marker，泳道1和2为PpIAA1基因，大小为768bp。图2为PpIAA1基因在CN13和CN16不同成熟期的表达情况。（a）果实成熟过程中基因PpIAA1的表达。（b）CN13采后1-MCP处理对基因PpIAA1表达的影响。（c、d）CN16采后乙烯或NAA处理对基因PpIAA1表达水平的影响。图3为PpIAA1直接结合并激活基因PpNCED2、PpNCED3、PpPG1和PpACS1的启动子活性。（a）酵母单杂交实验结果图。（b）双荧光素酶实验结果图。（c）桃果实中瞬时超表达PpIAA1基因结果图。图4为转基因阳性植株的PCR扩增产物电泳图。M为Marker，泳道1为野生型，泳道2～11为转基因株系。图5为WT和PpIAA1转基因株系叶片颜色比较图。图6为WT和PpIAA1转基因叶绿素含量（a）及其合成基因表达量（b）比较图。图7为WT和PpIAA1转基因株系叶片透射电镜比较图，图中PpIAA1表示PpIAA1转基因株系。图8为WT和PpIAA1转基因株系侧根数目比较图。图9为WT和PpIAA1转基因株系果实成熟期比较图。图10果实成熟时的乙烯释放和硬度变化图。（a）野生型WT和转基因株系PpIAA1-16、PpIAA1-21番茄成熟过程中乙烯的释放量，（b）野生型WT和转基因株系PpIAA1-16、PpIAA1-21番茄成熟过程中硬度变化。图11为番茄果实不同时期乙烯合成基因（SlACO1、SlACS2、SlACS4）、乙烯信号转导基因（SlEIL1、SlETR2）、果实成熟相关基因（SlNOR、SlRIN）和细胞壁降解相关基因（SlPG）的定量分析图。图12为WT和PpIAA1转基因株系果实采后0～4周变化图。图13为番茄果实采后的乙烯合成相关基因（SlACO1、SlACS2、SlACS4）、细胞彭压相关基因（SlCER1、SlPDF2）和细胞壁降解相关基因（SlPE、SlPG、SlPL）的定量分析图。图14为番茄采后不同时间细胞壁降解相关基因的表达分析图。（a）WT和转基因PpIAA1-16和PpIAA1-21番茄果实采后乙烯释放量。（b）WT和转基因PpIAA1-16和PpIAA1-21番茄果实采后果实硬度变化。图中WT表示野生型番茄，PpIAA1-16和PpIAA1-21分别表示转基因番茄株系16和21，DPA表示花后天数。图中*表示差异显著（p中国农业科学院郑州果树研究所桃生长素原初响应因子PpIAA1基因及其应用无14PatentInversion3.51768DNAPrunuspersica1atgaacatgccaccggatgctgttgacgatgatgatgtcagcaaaagcatggattttaag60gacactgagctcaccttaggactgcctggtcgtccacgacgttgttcttcatcagcagct120gatcatttcttcggaggaatcaagagtggtagctgcagcgtgaaacgggggttcatggag180accgttgatcagaatattggcctggaaagctttaccagctgcgagccacgtagccaaatc240aaagtggatgggaagttggaagctcattacaacaactactcctcctccagctcaagtagc300aggacaactactgccgtgaaatccccagctgcaatggcaagagtagttgggtggcctcca360gtgagatcgttgagacagaaggcgttggtggagagcaagatgaagagcaagagcacgtat420gtaaaagtgggtgcagatggagctccttacttgcggaaactagacttagacatgtacaaa480agttatcaggagctattgagagccttagaccaaatgttcccttccttcattacaagcggt540aagtatgtggaggatactacgagcaaccaggagcagcttatgaaacctgcagtgaaagga600atggatgaatatatggtgatgacatatgaagacaaggatggggactggatgttagttgga660gacgtcccttggaaaatgtttatagaatcatgcaagcgtattcggttgatgaaaagttca720gaggctgttgggatagctccaaggacgtctcaggttctgccacaatga7682255PRTPrunuspersica2MetAsnMetProProAspAlaValAspAspAspAspValSerLysSer151015MetAspPheLysAspThrGluLeuThrLeuGlyLeuProGlyArgPro202530ArgArgCysSerSerSerAlaAlaAspHisPhePheGlyGlyIleLys354045SerGlySerCysSerValLysArgGlyPheMetGluThrValAspGln505560AsnIleGlyLeuGluSerPheThrSerCysGluProArgSerGlnIle65707580LysValAspGly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权利要求：1.桃生长素原初响应因子PpIAA1基因在减少番茄侧根数目和或加深番茄叶片颜色中的应用，其特征在于，所述PpIAA1基因序列如SEQIDNO:1所示。2.桃生长素原初响应因子PpIAA1基因在促进番茄果实成熟和或减少番茄果实储藏时间中的应用，其特征在于，所述PpIAA1基因序列如SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，PpIAA1基因所编码的蛋白如SEQIDNO:2所示。4.含有权利要求1或2所述PpIAA1基因的植物重组表达载体。5.含有权利要求4所述重组载体的宿主细胞。6.桃生长素原初响应因子PpIAA1基因在植物育种中的应用，其特征在于，所述PpIAA1基因序列如SEQIDNO:1所示。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为番茄或桃。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，培育转PpIAA1基因番茄，具体包括：（1）构建含有所述PpIAA1基因的重组植物表达载体；（2）将所构建的重组植物表达载体转化到番茄细胞或组织中；（3）培育筛选得到转基因番茄。

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