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申请/专利权人：中国医学科学院北京协和医院

摘要：本发明提供了本发明涉及一种洋白蜡花粉变应原浸液物、其浸液及其制备方法。该洋白蜡花粉变应原浸提物，其中含有洋白蜡花粉变应原蛋白如SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。该浸液经洋白蜡花粉收集、干燥、脱脂、提取、超滤浓缩、冷冻干燥、复溶等工艺方法制得，其主要组分为洋白蜡花粉变应原、甘油、氯化钠、苯酚等。该洋白蜡花粉变应原浸液具有特异性高的特点，洋白蜡致敏蛋白组分提取充分，总生物效价稳定，有效期长，无菌效果好；其原液可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断、经适当稀释后可用于体外嗜碱性粒细胞活化试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断由洋白蜡花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。

主权项：1.一种洋白蜡花粉变应原浸提物，其特征在于，其含有洋白蜡花9粉6变应原蛋白Frap1，所述Frap1含有如SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。

全文数据：一种洋白蜡花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法技术领域本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种洋白蜡花粉变应原浸液物、其浸液及其制备方法。背景技术人们对变态反应疾病的认识始于“花粉热”，花粉热又称过敏性鼻炎。1911年Noon和Freeman首次利用花粉提取液来治疗花粉热，变态原疾病治疗的历史从此开始。目前，变态反应性疾病是全球性重大卫生问题之一。工业化国家超过25％的人口被变应性哮喘、变应性鼻结膜炎及变应性皮炎困扰，其中以变应性哮喘最为常见。吸入致敏花粉是引发变应性哮喘及其他呼吸道变态反应性疾病的最重要因素。VRTA—L.A等调查发现近50％的变态反应性疾病患者对草类花粉过敏。洋白蜡Fraxinuspennsylvanica原产北美，广泛存在于欧洲、美洲和亚洲；在我国广为栽培，多引种为行道及庭园树。其植物性状为乔木，小枝暗灰色，光滑有皮孔；圆锥花序生于前1年无叶的侧枝上，无毛；花药矩圆形，顶端有突尖；果实长圆筒形。洋白蜡的花期为每年的3—4月，花粉量极大，授粉季节大气中漂浮的浓度很高，因此是春季花粉症重要过敏原。近年来，北京地区多采用本植物作为行道树，因此，空气中含量也随之增高。现在变应原特异免疫治疗的方法主要分为皮下注射给药免疫治疗和舌下给药免疫治疗。皮下注射给药免疫治疗已有100多年历史，其安全性和有效性已经被得到证明。上世纪90年代初，变应原舌下滴剂疫苗诞生，1998年，WHO宣布了变应原舌下滴剂疫苗安全和有效。但是舌下给药免疫脱敏的方式相比皮下注射免疫给药，治疗周期长，短时间内疗效不显著，平均脱敏周期3-5年。在一个治疗周期中，舌下给药方式免疫脱敏给药量是皮下注射给药量的100倍。所以皮下注射给药免疫脱敏的方式相比舌下给药，虽然病人依从性差，但是治疗周期短，见效快，治疗费用低。目前，用于洋白蜡花粉变应原的作为皮下注射免疫制剂的稳定性差，成分不确定，试剂存放一定时间后用于诊断洋白蜡花粉诱发的变态反应疾病时，阳性率降低，准确性低。发明内容为了解决上述技术问题，本发明提供一种含洋白蜡花粉变应原浸液，该浸液具有于特异性高，洋白蜡致敏蛋白组分提取充分且比例恒定，总生物效价稳定，有效期长的特点。其可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断由洋白蜡花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：一种洋白蜡花粉变应原浸提物，其含有洋白蜡花粉变应原蛋白Frap1，所述Frap1含有如SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。一种洋白蜡花粉变应原浸液，所述变应原浸液中含如上所述的洋白蜡花粉变应原浸提物、体积比为0.2～0.4％的苯酚，体积比为45～55％的甘油和4.5～5.5gL的NaCl，其pH值为6.0～8.0。如上所述的洋白蜡花粉变应原浸液，优选地，所述洋白蜡花粉变应原的活性浓度为5000～20000BAUml，所述洋白蜡花粉变应原浸液的总蛋白浓度0.30～1.20mgml。进一步地，通过SDS-PAGE和WesternBlotting检测，所述洋白蜡花粉变应原的蛋白分布主要在分布在20kDa、22kDa、30kDa、35kDa、38kDa、58kDa、100kDa，其中20kDa为变应原主要蛋白成分。通过全蛋白质谱检测，所述洋白蜡花粉变应原浸提物主要包含且不限于如SEQIDNO.6-SEQIDNO.8所示的特征性肽段。通过双向电泳表明，所述洋白蜡花粉变应原的主要致敏蛋白等电点分布在3.5～8.5之间。如上所述的洋白蜡花粉变应原浸液的制备方法，其包括如下步骤：S1、采集洋白蜡花粉，常温干燥或真空干燥或流化床干燥；S2、对干燥后的花粉脱脂、干燥；S3、将脱脂干燥后的洋白蜡花粉按重量g体积ml比1:50～1:10加入pH为7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2～8℃搅拌22～26h进行浸提；S4、取步骤S3后的浸提液，离心取上清液；将上清液过滤及除菌过滤；S5、将过滤后的上清液进行超滤浓缩，获得超滤浓缩液；S6、将所述超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，真空冻干获得洋白蜡花粉变应原冻干品；S7、将所述洋白蜡花粉变应原冻干品用pH6.5～7.5磷酸盐—盐水缓冲液复溶配置为洋白蜡花粉变应原原液，2～8℃放置，与等体积灭菌的甘油混匀，调节溶液pH值至6.0～8.0。如上所述的制备方法，优选地，在步骤S2中，所述花粉脱脂采用花粉与丙酮以1：5～1:1的重量g体积ml比进行脱脂处理，重复脱脂至上层液体澄清。如上所述的制备方法，优选地，在步骤S4中，所述离心的条件为8000～12000g，离心温度2～8℃，时间为15～20min；所述过滤及除菌过滤为先用4000目滤布过滤后，再通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤。如上所述的制备方法，优选地，在步骤S5中，所述超滤浓缩用3KD超滤膜超滤，当超滤透过液总蛋白含量≤0.02mgml，停止超滤；当超滤透过液总蛋白含量0.02mgml，更换超滤膜之后对超滤透过液重复超滤，直至超滤透过液总蛋白含量≤0.02mgml为止。如上所述的制备方法，优选地，在步骤S6中，所述真空冻干的条件为-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％。如上所述的制备方法，优选地，所述步骤S1还包括对原料洋白蜡花粉进行镜检鉴别和或DNA鉴定的步骤，其中DNA鉴定方法为，以SEQIDNO.1、SEQIDNO.2为引物，对鉴别洋白蜡原料进行PCR扩增，并检测扩增产物。。如上所述的制备方法，优选地，所述磷酸盐—盐水缓冲液包括4.5～5.5gL的氯化钠、0.03％～0.05％的磷酸二氢钾、1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠和0.2％～0.4％的苯酚。在制备洋白蜡花粉变应原进行浸提时，发明人尝试了多种浸提液，并且比较了它们的浸提效率。所使用的浸提液包括：0.8％的氯化钠、pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH8.2的coca’s液、pH8.9的Tris-盐酸缓冲液、pH为7.9～8.2的含有4.5～5.5gL的氯化钠及重量百分比含量为0.03％～0.05％的磷酸二氢钾，1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠，0.2％～0.4％的苯酚等。实验结果证实，使用pH为7.9～8.2的含有4.5～5.5gL的氯化钠及0.03％～0.05％的磷酸二氢钾，1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠，0.2％～0.4％的苯酚的浸提效率较高，且制备的洋白蜡花粉变应原浸液可长期有效的保存，稳定性高。一种洋白蜡花粉变应原冻干品，其特征在于，其由包括洋白蜡花粉收集-干燥-脱脂-提取-超滤浓缩-冻干的步骤制得：1收集：花粉采集由专业人员进行，用自然脱落法收集；2干燥：常温干燥或真空干燥或流化床干燥，直至花粉不再粘附，将干燥后的花粉过150～250目分样筛；3脱脂：将2所得到的花粉与丙酮分别按g与ml计，以1：5～1:1的重量体积比进行脱脂处理，振荡脱脂30分钟后，静置分层，倒出上层液，加入新的丙酮，重复脱脂至上层液体澄清，将脱脂后的花粉均匀摊开，室温下干燥48小时以上；4提取：将脱脂干燥后的洋白蜡花粉按重量体积比1:50～1:10加入10L，pH7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2-8℃搅拌22～26h进行浸提；取提取后的浸提液，在离心力8000～12000g，离心温度2～8℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清；先用4000目滤布过滤后，将滤液依次通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；5超滤浓缩：将过滤后的浸提液，用3KD超滤膜超滤，取样超滤浓缩液、超滤透过液，检测其总蛋白含量；其中，当超滤透过液中总蛋白含量≤0.02mgml，则直接排弃透过液；超滤透过液总蛋白含量0.02mgml，则对超滤膜进行完整性测试，超滤膜未破损，则排弃透过液；若超滤膜破损，则更换超滤膜之后对透过液重复超滤；6冻干：将超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，按照冻干工艺条件，-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％，获得洋白蜡花粉变应原冻干品。如上所述洋白蜡花粉变应原浸提物、洋白蜡花粉变应原浸液及所述洋白蜡花粉变应原冻干品的应用，用于在制备诊断变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗制剂中的应用，所述诊断变态反应疾病包括过敏性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和慢性荨麻疹。进一步，所述洋白蜡花粉变应原浸提物冻干品用于制备成片剂、口崩片，所述洋白蜡花粉变应原浸液用于制备注射液、舌下滴剂、变应原斑贴剂、变应原浸液稀释液。本发明提供的洋白蜡花粉变应原浸液用于制备治疗洋白蜡花粉过敏性疾病的药物使用。具体而言，采用本发明提供的洋白蜡花粉变应原浸液或冻干品按治疗有效量或诊断有效量的洋白蜡花粉变应原、以及药学上可接受的载体可制备用于治疗洋白蜡花粉过敏性疾病的药物。用于治疗洋白蜡花粉过敏性疾病的药物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者年龄、体重和大致疾病状况等因素确定对病人有益的剂量进行施用。用于治疗洋白蜡花粉过敏性疾病的药物的剂型选自口服剂、皮下注射剂、舌下含服剂、气雾剂、鼻腔剂、或皮肤点刺剂等液体剂型；优选皮下注射剂、舌下含服剂、或皮肤点刺剂。其中，皮下注射剂、舌下含服剂一般是作为特异性免疫治疗时常用的剂型，而皮肤点刺剂是作为体内变应原检测时常用的剂型。当采用本发明洋白蜡花粉变应原浸液应用于诊断由洋白蜡花粉引起的过敏性疾病时即变应原皮肤点刺诊断试验，除了本发明洋白蜡花粉变应原浸液外，一般还应包括阴性对照液、阳性对照液、以及点刺针。阴性对照液一般为对人体无过敏性反应的液体例如甘油与盐溶液的混合物等，阳性对照液一般为1.0～5.0mgml的磷酸组胺盐酸组胺溶液。本发明制备的洋白蜡花粉变应原浸液可应用于斑贴试验中。其原理为：将可疑致敏物质变应原敷贴于患者皮肤上，通过皮肤或粘膜进入机体后由抗原呈递细胞将抗原呈递给T淋巴细胞，使特异性T淋巴细胞活化，诱发炎症反应。本发明的有益效果在于：1、洋白蜡作为北方地区主要花粉过敏原，本发明提供的洋白蜡花粉变应原浸液可以有效诊断由洋白蜡花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。2、加入稳定剂甘油，提高了稳定性和缓释作用，提高了用药的有效性和安全性。3、变态反应疾病皮下注射免疫脱敏给药方式，相比舌下含服滴剂给药方式，见效快，周期短。整个治疗周期给药剂量远小于舌下滴剂给药量约100倍，其治疗费用远小于舌下滴剂给药免疫脱敏，减轻患者的医疗负担。4、本发明通过使用制备的应变原浸液以原液做点刺试验分别与变态反应专科医生临床综合特异性诊断和血清特异性IgEspecificIgE，sIgE诊断进行对比，评价皮内试验结果与临床综合特异性诊断及与血清sIgE诊断的结果一致、具有较好的灵敏度和特异度，安全性好。5、本发明通过使用制备的变应原浸液以1：103～108稀释后做体外嗜碱性粒细胞活化试验，能临床特异性诊断洋白蜡过敏患者，避免部分体外sIgE检测假阳性，同时也能避免变应原皮肤试验点刺或皮内给部分洋白蜡花粉过敏患者带来过敏性休克的风险。本发明提供的洋白蜡花粉变应原浸液具有特异性高的特点，洋白蜡致敏蛋白组分提取充分，总生物效价稳定，有效期长，无菌效果好，可作为标准品使用；可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断由洋白蜡花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。可实现标准化控制，使用有效期有效延长，能带来较好的经济效益。本发明方法通过冻干复溶后得到的浸液，相比北京协和医院研制的洋白蜡花粉变应原注射原液更稳定，生物效价和蛋白含量都比较稳定，且效期为3年。附图说明图1为洋白蜡花粉原料ITS2序列PCR电泳结果。。图2为不同批次洋白蜡花粉不同脱脂时间脂肪含量变化趋势。图3为洋白蜡花粉浸液总蛋白含量与浸提时间的关系。图4为洋白蜡花粉变应原浸液SDS-PAGE蛋白电泳结果示意成分鉴别。图5为洋白蜡花粉变应原浸液与洋白蜡过敏患者血清WesternBlotting反应检测结果示意洋白蜡变应原成分鉴别。图6为洋白蜡花粉变应原浸液双向电泳测量等电点结果。图7为洋白蜡花粉变应原浸液产品pH值在长期稳定性试验中的测试结果。图8为洋白蜡花粉变应原浸液产品苯酚含量在长期稳定性试验中的测试结果。图9、洋白蜡花粉变应原浸液产品甘油含量在长期稳定性试验中的测试结果。图10为洋白蜡花粉变应原浸液产品氯化钠含量在长期稳定性试验中的测试结果。图11为洋白蜡花粉变应原浸液产品总蛋白含量在长期稳定性试验中的测试结果。图12为洋白蜡花粉变应原浸液产品总应变原活性在长期稳定性试验中的测试结果。图13为洋白蜡变应原浸液与洋白蜡变应原注射液医疗机构制剂品种稳定性WesternBlotting对比研究图14为洋白蜡花粉变应原浸液产品应用于临床洋白蜡花粉过敏患者体外嗜碱性粒细胞活化试验结果示例。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1洋白蜡花粉的鉴别由于原料的鉴别和纯度对于后续变应原诊断及治疗制剂极为重要，本实施例采用DNA特异性序列检测加显微镜检对洋白蜡原料进行双重鉴别及质控。1、洋白蜡花粉DNA提取采用天根快速DNA提取扩增试剂盒天根生化KG203。提取方法：称取5mg洋白蜡花粉样品置于1.5mL离心管中，加入Buffer1100μl后用一次性研磨杵将样品彻底研碎后加入Buffer2100μl后震荡混匀，离心机12000rmin离心5min后取上清液于新的离心管中作为DNA模版备用。2、引物设计及合成引物序列如下：FraITS2-FSEQIDNO.1：5'-CTGAGAAACGGCTACCACATC-3'FraITS2-RSEQIDNO.2：5'-GTCGGCCAAGGCTATAAACTC-3'2、PCR反应体系PCR扩增试剂盒天根生化。对提取的DNA采用如下25μl体系的配制PCR反应体系见表1：对实施例1中制备洋白蜡花粉变应原冻干品，进行DNA的提取，对提取的DNA采用如下50μl体系的配制PCR反应体系如表1：表1洋白蜡花粉ITS2序列PCR反应体系4、PCR反应条件见表2.表2.洋白蜡花粉ITS2序列PCR反应条件1％琼脂糖电泳，150V、100mA20min电泳观察。电泳结果如图1所示。其中L1、L2、L3为3批洋白蜡花粉PCR产物，Lmix是上述3批洋白蜡花粉混合原料PCR产物，DNAMarker如图1所示。5、测序利用PCR产物纯化回收试剂盒生工SK1141，回收PCR产物进行测序，测序结果编号FraITS2，如SEQIDNO.3所示。5、洋白蜡的显微镜检洋白蜡花粉显微镜下形态学鉴别：花粉粒扁球形。极面观多为正方形，赤道面观扁圆形，大小约21×25微米。具4～5孔沟。外壁外层厚于内层，表面具明显的细网状纹饰。实施例2洋白蜡花粉脱脂及浸提关健工艺步重要参数的确定1、洋白蜡花粉脱脂工艺步参数确定1将洋白蜡花粉g与丙酮ml以1：2的重量体积比wv进行脱脂处理。对不同批次不同采集时间的洋白蜡花粉不同脱脂时间样品进行脂肪含量进行检测，以确定最优的脱脂时间。采用海能SOX500脂肪测定仪测定洋白蜡花粉中脂肪含量，通过索式萃取及干燥称重的方法，对比萃前后花粉重量的变化，得到相对应的脂肪含量，并根据脂肪含量结果对之后脱脂后花粉进行质量控制.结果见图2，可见丙酮脱脂时间为30min后，脂肪含量几乎不随脱脂时间延长而下降，因此脱脂时间确定为30min。2脱脂参数的验证：对不同批次不同采集时间的洋白蜡花粉进行30min脱脂后检测脂肪含量，结果如表3所示。表3.不同批次洋白蜡花粉脱脂30min后脂肪含量降低百分比结果得知，洋白蜡花粉中脂肪含量在0.2％-5％左右，故在之后脱脂过程中，脱脂后的洋白蜡花粉在脂肪含量上应该下降0.2-5％左右，也就是花粉总重同比也应该下降0.2-5％左右。2、洋白蜡花粉蛋白浸提工艺步重要参数确定1将洋白蜡花粉g与丙酮ml以1：2的重量体积比wv进行搅拌或振荡脱脂30分钟处理，静置分层，观察上层液体澄清情况，重复脱脂至上层液体澄清后，将脱脂后的花粉均匀摊开，室温下干燥48小时以上。2将脱脂干燥后的洋白蜡花粉按重量体积比1:10加入10L，pH7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2～8℃，在搅拌速度为250rpm条件下，在搅拌时间分别为3h、6h、9h、12h、18h、24h、48h、72h等提取点时，将提取后的提取液，将浸提液全部加入到离心桶内，调节平衡，离心力8000～12000g，离心温度4℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清。3将离心分离后的上清液先用4000目滤布过滤后，通过纸板过滤，0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；得到洋白蜡花粉粗提取液。取样以Bradford法测定蛋白含量，结果见“图3、洋白蜡花粉浸液总蛋白含量与浸提时间的关系”。如图3结果表明，在蛋白提取过程中，随搅拌提取时间延长，蛋白提取含量增大，提取时间24h含量达到最高1374±11μgml，可见蛋白类物质提取时间过长会影响其蛋白含量，故提取时间优选为22～26h左右。实施例3洋白蜡花粉原料工艺1、花粉采集自然脱落法，收集洋白蜡花粉。常温或真空或流化床干燥，直至花粉不再粘附。将干燥后的花粉过150～250目分样筛，本实施例中优选为180目分样筛。2、干燥将花粉摊放于通风干燥处自然干燥，或真空干燥、或流化床干燥6-48h，直至花粉不再粘附。3、脱脂将上述所得花粉g与丙酮ml以1：5～1:1的重量体积比wv进行脱脂处理。本实施例中优选为1：2。搅拌或振荡脱脂30分钟后，静置分层，观察上层液体澄清情况。倒出上层液，加入新的丙酮，重复脱脂至上层液体澄清。4、再干燥将脱脂后的花粉均匀摊开，室温干燥、或真空干燥、或流化床干燥6-48h。5、杂质控制1显微镜下用颗粒计数法测定，其中的杂质颗粒含量应满足如下标准：孢子含量≤1％，无关花粉含量≤2％，其它杂质含量≤10％。2重金属及有害元素总重金属≤50mgkg；砷≤5mgkg。3丙酮残留丙酮残留量≤0.5％体积分数。实施例4洋白蜡花粉变应原原液冻干品制备工艺1、依“实施例3洋白蜡花粉原料工艺”制备洋白蜡花粉原料。2、浸提将脱脂干燥后的洋白蜡花粉按重量体积比1:50～1:10加入10L，本实施例中优选为1：20，以pH7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2-8℃搅拌22～26h进行浸提。其中以配制1000ml磷酸盐—盐水缓冲液pH8.2为例的配方如表4。磷酸盐—盐水缓冲液充分溶解后除菌过滤，2～8℃放置，保存期不超过30天。表4磷酸盐—盐水缓冲液pH8.2配方3、固液分离取提取后的浸提液，将浸提液全部加入到离心桶内，调节平衡，离心力8000～12000g，离心温度2～8℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清；4、澄清将离心分离后的上清液先用4000目滤布过滤后，将滤液依次通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；5、超滤、透析、浓缩过滤后的浸提液，用3KD或1KD超滤膜切向流超滤，优选地，本实施例中用3KD超滤膜超滤。透析液选用25-125mM的NH4HCO3，本实施例中优选为50mM的NH4HCO3。根据蛋白含量质量标准，超滤浓缩至适当体积，检测蛋白含量至质量标准的总蛋白含量区间。取样超滤浓缩液、超滤透过液，检测其总蛋白含量。当超滤透过液中总蛋白含量≤0.02mgml，则直接排弃透过液；超滤透过液总蛋白含量0.02mgml，则对超滤膜进行完整性测试，超滤膜未破损，则排弃透过液；若超滤膜破损，则更换超滤膜之后对透过液重复超滤。6、无菌过滤用0.22μm膜除菌过滤。7、冻干按照冻干工艺条件，-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％；获得洋白蜡花粉变应原原液冻干品。实施例5洋白蜡花粉变应原浸液成品制备工艺1、复溶将实施例4中制备的洋白蜡花粉变应原冻干品用磷酸盐—盐水缓冲液pH6.5～7.5，配方见表5复溶，至总蛋白含量位于质量标准2倍范围区间。2～8℃放置。表5.磷酸盐—盐水缓冲液pH值6.5～7.5配制2、半成品配制原液复溶后，在净化车间内A级洁净条件下，将复溶液与等体积预先湿热灭菌121℃、30分钟并冷却的甘油混匀，调节溶液pH值至6.0～8.0。3、半成品除菌过滤、无菌分装为成品在净化车间内A级洁净条件下，将半成品通过0.22μm滤膜除菌过滤，无菌分装为成品，得到pH6.0～8.0浅黄色至棕色液体即为洋白蜡花粉标准化变应原浸液成品。实施例6洋白蜡花粉变应原浸液成品质量控制1、洋白蜡花粉标准化变应原浸液中总蛋白成分SDS-PAGE法鉴别采用还原型SDS-PAGE法,通过上样-跑胶-染色-脱色四步，其中分离胶浓度为4～12％，考马斯亮蓝染色。通过SDS-PAGE检测，结果如图4，M为GenstarMarker，R为内部参考品，L1，L2和L3为不同批次洋白蜡花粉标准化变应原浸液，其蛋白主要分布在20kDa、22kDa、30kDa、35kDa、38kDa、58kDa、100kDa左右。其中鉴定的致敏蛋白分子量、过敏血清阳性率、对应全蛋白质谱鉴定肽段概览见表6。2、洋白蜡花粉标准化变应原浸总变应原成分WesternBlotting法鉴别采用还原型SDS-PAG电泳，分离胶浓度为4～12％，0.2μmPVDFImmobilonR-PSQ转印膜，一抗血清反应稀释度1：3，室温杂交2h，随后置于4℃冰箱杂交过夜，1×PBST洗3次，10min次。。二抗MsmAbtoHuIgEab998061：1000室温杂交2h，1×PBST洗3次，10min次。将ECL显影液A液和B液1:1混匀后曝光显色。结果见图5所示。其中，M为蛋白分子量MarkerGenstarMarker，R为内部参考品，N为浸液与健康受试者血清反应条带，P1-P10分别为浸液与22例临床确诊的洋白蜡过敏阳性患者sIgE≥3级，皮试≥+++，典型的夏秋季花粉症病史血清反应条带结果，其中致敏Frap1，FrapX1-6及的分子量及过敏血清阳性率汇总如表6，由此确定血清阳性率最高Frap120kDa为洋白蜡花粉的主要致敏蛋白。表6洋白蜡花粉致敏蛋白分子量、过敏血清阳性率情况概览3、致敏蛋白序列测定本发明产品对相应致敏蛋白见表6进行了全蛋白序列测定，并对洋白蜡花粉原料中每一致敏蛋白对应mRNA进行了核苷酸全长测序，致敏蛋白代码、序列标识及氨基酸全长序列、对应mRNA全长序列结果详见表6。其中本发明所含洋白蜡花粉致敏蛋白的全序列依次为：Frap1致敏蛋白全序列为SEQIDNO.4：MARPIQVSILFIVALCFLSLLDIVYSEDVPQPPVSQFHIQGQVYCDTCRARFITELSEFIPGAGVRLQCRDGEKGKITFTEVGYTRAEGLYSMLIERDHKNEFCEISLISSSRKDCDEIPVEGWVKPSLKFKLNTVNGTTRTINPLGFFKKEALPKCPQVFNKLGMYPPDL通过对洋白蜡花粉原料中上述每一致敏蛋白对应mRNA进行了核苷酸全长测序后，其mRNA对应序列如下Frap1致敏蛋白基因全序列为SEQIDNO.5：ATGGCAAGGCCTATCCAAGTTTCAATTCTTTTCATTGTAGCTTTATGCTTCTTGTCCCTCCTTGACATCGTCTACTCAGAAGACGTTCCCCAACCACCAGTTTCTCAATTTCACATTCAGGGACAAGTTTATTGTGACACATGTCGTGCTCGATTTATTACGGAACTTAGCGAGTTTATCCCAGGTGCCGGTGTACGTCTCCAGTGCAGAGACGGAGAGAAAGGAAAGATAACATTTACTGAGGTTGGTTACACGAGAGCAGAAGGACTCTATAGCATGCTTATTGAACGTGATCACAAGAACGAATTTTGCGAAATTTCACTTATTTCAAGTAGCAGAAAAGATTGCGATGAAATCCCCGTTGAAGGATGGGTAAAACCCTCATTAAAATTTAAGCTCAACACCGTAAATGGTACCACACGCACGATAAATCCTCTTGGATTCTTTAAGAAAGAAGCTCTTCCAAAATGTCCACAAGTCTTTAATAAATTGGGTATGTATCCCCCGGATCTGTGA4、质谱检测对洋白蜡变应原浸液进行全蛋白质谱分析以及对洋白蜡变应原经SDS-PAGE分离后对应的胶条分别取样进行质谱鉴定，其主要包含且不限于以下肽段：Frap1质谱鉴定的肽段：SEQIDNO.6：AEGLYSMLIERSEQIDNO.7：FITELSEFIPGAGVRSEQIDNO.8：TINPLGFFK5、双向电泳测定致敏蛋白等电点双向电泳结果表明洋白蜡花粉主要致敏蛋白等电点分布在3.5-8.5之间如图6所示。6、理化性质检测该洋白蜡变应原浸液经理化性质检验后，其质量标准如表7：表7洋白蜡花粉变应原浸液理化性质质量标准7、总变应原活性测定当变应原浸液包含治疗有效量或诊断有效量的洋白蜡花粉变应原时，用竞争性ELISA法测定相对生物效价为5000BAUml-20000BAUml。8、无菌检查不得有菌生长。实施例6稳定性试验对实施例5制备的洋白蜡花粉标准化变应原浸液成品在2-8℃下进行长期稳定性研究试验，分别对三个批次样品分别检测0时，3个月，6个月，9个月和12个月的pH值变化，苯酚含量，甘油含量，氯化钠含量、蛋白含量和总生物效价的变化情况，结果如图7至图12所示。从上述稳定性结果中，可以发现在12个月长期试验中，洋白蜡花粉标准化变应原浸液各质控参数虽有不规则波动，可能是实验误差导致，但均在质量标准质控范围内，且不同批次间变化趋势基本一致，这说明按照本发明所述的洋白蜡花粉标准化变应原浸液，在2-8℃条件下，12月内能稳定地保存。因此，洋白蜡花粉变应原浸液成品的效期合理预计在36个月。实施例7本发明洋白蜡变应原浸液与洋白蜡变应原注射液医疗机构制剂北京协和医院品种稳定性WesternBlotting对比研究本发明变应原浸液组方中加入了50％的甘油作为稳定剂，优化了磷酸盐缓冲液pH及配方，使其更适合花粉变应原的浸提及保存，且原料经DNA条码技术鉴定，保障了纯度，原液采用了优化的冻干工艺，上述设计及工艺实现使按发明获得的变应原浸液成品稳定好、变应原活性得到良好保存，从而提高临床使用的有效性和安全性。为验证本发明下的处方及工艺对洋白蜡变应原活性保存优于已有工艺及处方配制的同品种洋白蜡变应原粗提液，本实施例针对洋白蜡变应原浸液本发明，即下述为A的产品及洋白蜡变应原注射液医疗机构制剂北京协和医院配制，采用pH为8.2的Coca’s液提取，主要成分0.5％的NaCl、0.275％NaHCO3、0.4％苯酚和注射用水，即下述为B的产品做了稳定性对比研究。本实施例通过对比A产品和B产品4℃温度控制2～6℃，避光保存长期放置12月后，分别在0点和12月取样，以产品与洋白蜡过敏患者血清池15例洋白蜡过敏患者组成的血清池，sIgE≥3级，皮试≥+++，典型的夏秋季花粉症病史者入选的WesternBlotting反应评价稳定性差异。试验采用还原型SDS-PAG电泳，分离胶浓度为4～12％，0.2μmPVDFImmobilonR-PSQ转印膜，一抗血清反应稀释度1：3，室温杂交2h，随后置于4℃冰箱杂交过夜，1×PBST洗3次，10min次。。二抗MsmAbtoHuIgEab998061：1000室温杂交2h，1×PBST洗3次，10min次。将ECL显影液1:1混匀后曝光显色。结果见图13所示，其中，M为蛋白分子量MarkerGenstar，N为浸液与健康受试者血清反应条带，L1和L2分别为本发明产品0时A0和12月A12与血清池反应结果，L3和L4分别为原医院制剂0时B0和12月B12与临床血清池反应条带结果。结果表明，本发明产品比原医院制剂产品在4℃放置12月后，不仅主要致敏蛋白条带清晰，其余多个致敏条带反应仍较明显，说明本发明产品中洋白蜡致敏蛋白更为丰富，保存较好，活性也较高从而证实本发明产品更为稳定、有效。实施例8评价应用1评价本发明制备的洋白蜡花粉变应原浸液用于诊断洋白蜡花粉过敏的有效性和安全性。方法：选择2015年8月10日至2016年4月25日，于北京协和医院变态反应科就诊的患有过敏性结膜炎、过敏性鼻炎、过敏性哮喘、特应性皮炎等过敏性疾病的门诊患者1029例。所有受试者接受洋白蜡花粉皮肤点刺试验skinpricktest,SPT,以平均风团直径meanwhealdiameter,MWD判读结果。以洋白蜡花粉sIgE为标准，做受试者工作特征曲线receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC曲线分析。在不同诊断界值下,分析洋白蜡花粉变应原浸液用于诊断洋白蜡花粉过敏的准确性。记录不良事件,评价安全性。结果：本研究共计入组1029例，无脱落，剔除率25.75％2651029。安全集saveset，SS1029例，全分析集fullanalysisset，FAS1006例，符合方案集perprotocolset，PPS764例年龄最小5.7岁，最大65.3岁。FAS的ROC曲线下面积areaundercurve，AUC为0.85295％可信区间0.829～0.876，PPS的AUC为0.87095％可信区间0.845～0.894。据PPS的ROC曲线估算洋白蜡花粉SPT的最佳诊断界值为MWD3.75mm，特异度达95％时的诊断界值为MWD4.75mm。分别以MWD3、3.75、4.75mm为诊断界值,洋白蜡花粉变应原浸液用于诊断洋白蜡花粉过敏的敏感度依次降低，分别为0.860295％可信区间0.8287～0.8917、0.20495％可信区间0.6796～0.7612、0.554895％可信区间0.5097～0.6000；特异度依次升高，分别为0.689095％可信区间0.6365～0.7414、0.893095％可信区间0.8579～0.9280、0.953295％可信区间0.9292～0.9771。6例受试者出现7次不良事件,不良事件发生率00583％61029,主要表现为流鼻涕、打喷嚏、鼻痒、鼻堵、眼痒、点刺局部皮肤反应等。无严重不良事件。结论：洋白蜡花粉变应原浸液用于诊断洋白蜡花粉过敏有较好的诊断价值，安全性好。结合病史和不同的诊断界值，可以提高诊断的准确性。实施例9评价应用2本发明的制备的洋白蜡花粉变应原浸液对洋白蜡花粉过敏患者全血进行嗜碱性粒细胞活化试验，能进行临床特异性过敏体外诊断。这个检测方法在IgE或非IgE介导的过敏反应中均适用，可以用于部分sIgE体外诊断存在假阴性、假阳性患者的确诊及部分过敏性休克患者不适于进行皮试诊断的情况。试验原理：变应原与患者全血细胞反应可以模拟人体内变态反应过程：即特异性IgE抗体通过与相应的变应原桥联结合到细胞表面，激活细胞内信号级联导致嗜碱性粒细胞CCR3持续表达于嗜碱性粒细胞，是其特异性标记的活化脱颗粒。在这个脱颗粒的过程中，细胞内复合物影响跨膜蛋白CD63gp53，使其外表达于细胞表面，并暴露于细胞外基质中，因此可以依赖流式细胞术原理使用抗人趋化因子受体CCR3-藻红蛋白anti-CCR3-PE对嗜碱性粒细胞进行标记，使用抗人CD63单克隆抗体-异硫氰酸荧光素anti-CD63-FITC对活化状态的嗜碱性粒细胞进行标记，非特异性细胞活化剂fMLP作为一种阳性质控，并以嗜碱性粒细胞脱颗粒的百分数变化来判断受试者是否对特定变应原过敏。方法：选择健康受试者、洋白蜡过敏患者，取其EDTA抗凝全血样本，以刺激缓冲液阴性对照、洋白蜡变应原浸液对1：103～1010稀释比例进行优化，本实施例中取1：108、fMLP刺激液阳性质控作为嗜碱性粒细胞的激活物，加入到全血中，然后加入anti-CD63-FITC、anti-CCR3-PE染色，48h内上流式细胞仪进行检测。结果：如图14所示。说明健康受试者以阴性对照、洋白蜡变应原浸液、阳性对照为嗜碱性粒细胞活化物时，其嗜碱性粒细胞活化率分别应＜15％、＜15％、≥15％，洋白蜡花粉过敏患者以阴性对照、洋白蜡变应原浸液、阳性对照为嗜碱性粒细胞活化物时，其嗜碱性粒细胞活化率分别应＜15％、≥15％、≥15％。结论：该洋白蜡变应原浸液能有效作为活化物运用于嗜碱性粒细胞活化试验，并依据其判断标准有效做出临床诊断。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表中国医学科学院北京协和医院一种洋白蜡花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法20181024367042019-03-238SIPOSequenceListing1.0221DNA人工序列ArtificialSequence2ctgagaaacggctaccacatc21321DNA人工序列ArtificialSequence3gtcggccaaggctataaactc214995DNA人工序列ArtificialSequence4ctaagggcatcacagacctgttattgcctcaaacttccttggcctaagcggccatagtcc60ctctaagaagctggccgcggagggaatcctccgcatagctagttagcaggctgaggtctc120gttcgttaacggaattaaccagacaaatcgctccaccaactaagaacggccatgcaccac180cacccatagaatcaagaaagagctctcaatctgtcaatccttactatgtctggacctggt240aagtttccccgtgttgagtcaaattaagccgcaggctccactcctggtggtgcccttccg300tcaattcctttaagtttcagccttgcgaccatactccccccggaacccaaaaactttgat360ttctcataaggtgctggcggagtcctaaaagcaacatccgccaatccctggtcggcatcg420tttatggttgagactaggacggtatctgatcgtcttcgagcccccaactttcgttcttga480ttaatgaaaacatccttggcaaatgctttcgcagttgttcgtctttcataaatccaagaa540tttcacctctgactatgaaatacgaatgcccccgactgtccctgttaatcattactccga600tcccgaaggccaacagaataggaccgaaatcctatgatgttatcccatgctaatgtatac660agagcgtaggcttgctttgagcactctaatttcttcaaagtaacagcaccggaggcacga720cccggccaattaaagccaggagcgcatcgccggtagaaagggacgagccgaccggtgcac780accggagcggaccgatcgacccaacccaaggtccaactacgagctttttaactgcaacaa840cttaaatatacgctattggagctggaattaccgcggctgctggcaccagacttgccctcc900aatggatcctcgttaagggatttagattgtactcattccaattaccagactcgtagagcc960cggtattgttatttattgtcactacctccccgtgt9955171PRTaminoacid5MetAlaArgProIleGlnValSerIleLeuPheIleValAlaLeuCys151015PheLeuSerLeuLeuAspIleValTyrSerGluAspValProGlnPro202530ProValSerGlnPheHisIleGlnGlyGlnValTyrCysAspThrCys354045ArgAlaArgPheIleThrGluLeuSerGluPheIleProGlyAlaGly505560ValArgLeuGlnCysArgAspGlyGluLysGlyLysIleThrPheThr65707580GluValGlyTyrThrArgAlaGluGlyLeuTyrSerMetLeuIleGlu859095ArgAspHisLysAsnGluPheCysGluIleSerLeuIleSerSerSer100105110ArgLysAspCysAspGluIleProValGluGlyTrpValLysProSer115120125LeuLysPheLysLeuAsnThrValAsnGlyThrThrArgThrIleAsn130135140ProLeuGlyPhePheLysLysGluAlaLeuProLysCysProGlnVal145150155160PheAsnLysLeuGlyMetTyrProProAspLeu1651704516DNA人工序列ArtificialSequence4atggcaaggcctatccaagtttcaattcttttcattgtagctttatgcttcttgtccctc60cttgacatcgtctactcagaagacgttccccaaccaccagtttctcaatttcacattcag120ggacaagtttattgtgacacatgtcgtgctcgatttattacggaacttagcgagtttatc180ccaggtgccggtgtacgtctccagtgcagagacggagagaaaggaaagataacatttact240gaggttggttacacgagagcagaaggactctatagcatgcttattgaacgtgatcacaag300aacgaattttgcgaaatttcacttatttcaagtagcagaaaagattgcgatgaaatcccc360gttgaaggatgggtaaaaccctcattaaaatttaagctcaacaccgtaaatggtaccaca420cgcacgataaatcctcttggattctttaagaaagaagctcttccaaaatgtccacaagtc480tttaataaattgggtatgtatcccccggatctgtga516611PRTaminoacid6AlaGluGlyLeuTyrSerMetLeuIleGluArg1510715PRTaminoacid7PheIleThrGluLeuSerGluPheIleProGlyAlaGlyValArg15101589PRTaminoacid8ThrIleAsnProLeuGlyPhePheLys15

权利要求：1.一种洋白蜡花粉变应原浸提物，其特征在于，其含有洋白蜡花9粉6变应原蛋白Frap1，所述Frap1含有如SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。2.一种洋白蜡花粉变应原浸液，其特征在于，所述变应原浸液中含如权利要求1所述的洋白蜡花粉变应原浸提物、体积比为0.2～0.4％的苯酚、体积比为45-55％的甘油和4.5～5.5gL的NaCl，其pH值为6.0～8.0。3.根据权利要求2所述的洋白蜡花粉变应原浸液，其特征在于，所述洋白蜡花粉变应原的活性浓度为5000～20000BAUml。4.根据权利要求2所述的洋白蜡花粉变应原浸液，其特征在于，所述洋白蜡花粉变应原浸液的总蛋白浓度0.30～1.20mgml。5.根据权利要求2所述的洋白蜡花粉变应原浸液，其特征在于，通过SDS-PAGE和WesternBlotting检测，所述洋白蜡花粉变应原的蛋白分布主要分布在20kDa、22kDa、30kDa、35kDa、38kDa、58kDa、100kDa。6.根据权利要求2所述的洋白蜡花粉变应原浸液，其特征在于，通过全蛋白质谱检测，所述洋白蜡花粉变应原浸提物主要包含且不限于如SEQIDNO.6-SEQIDNO.8所示的特征性肽段。7.一种根据权利要求2-6中任一项所述洋白蜡花粉变应原浸液的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：S1、采集洋白蜡花粉，常温干燥或真空干燥或流化床干燥；S2、对干燥后的花粉脱脂、干燥；S3、将脱脂干燥后的洋白蜡花粉按重量g体积ml比1:50～1:10加入pH为7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2-8℃搅拌22～26h进行浸提；S4、取步骤S3后的浸提液，离心取上清液；将上清液过滤及除菌过滤；S5、将过滤后的上清液进行超滤浓缩，获得超滤浓缩液；S6、将所述超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，真空冻干获得洋白蜡花粉变应原冻干品；S7、将所述洋白蜡花粉变应原冻干品用pH6.5～7.5磷酸盐—盐水缓冲液复溶配置为洋白蜡花粉变应原原液，2～8℃放置，与等体积灭菌的甘油混匀，调节溶液pH值至6.0～8.0。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述花粉脱脂采用花粉与丙酮以1：5～1:1的重量g体积ml比进行脱脂处理，重复脱脂至上层液体澄清。9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，所述离心的条件为8000～12000g，离心温度2～8℃，时间为15～20min；所述过滤及除菌过滤为先用4000目滤布过滤后，再通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤。10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述超滤浓缩用3KD超滤膜超滤，当超滤透过液总蛋白含量≤0.02mgml，停止超滤；当超滤透过液总蛋白含量0.02mgml，更换超滤膜之后对超滤透过液重复超滤，直至超滤透过液总蛋白含量≤0.02mgml为止；在步骤S6中，所述真空冻干的条件为-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％。11.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1还包括对原料洋白蜡花粉进行镜检鉴别和或DNA鉴定的步骤，其中DNA鉴定方法为，以SEQIDNO.1、SEQIDNO.2为引物，对鉴别洋白蜡原料进行PCR扩增，并检测扩增产物。12.一种洋白蜡花粉变应原冻干品，其特征在于，其由包括洋白蜡花粉收集-干燥-脱脂-提取-超滤浓缩-冻干的步骤制得：1收集：用自然脱落法收集；2干燥：常温干燥或真空干燥或流化床干燥，直至花粉不再粘附，将干燥后的花粉过150～250目分样筛；3脱脂：将2所得到的花粉与丙酮分别按g与ml计，以1：5～1:1的重量体积比进行脱脂处理，搅拌或振荡脱脂30分钟后，静置分层，倒出上层液，加入新的丙酮，重复脱脂至上层液体澄清，将脱脂后的花粉均匀摊开，室温或采用真空干燥或流化床干燥干燥48小时至72小时；4提取：将脱脂干燥后的洋白蜡花粉按重量体积比1:50～1:10加入10L，pH7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2-8℃搅拌22～26h进行浸提；取提取后的浸提液，在离心力8000～12000g，离心温度2～8℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清；先用4000目滤布过滤后，将滤液依次通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；5超滤浓缩：将过滤后的浸提液，用3KD超滤膜超滤，取样超滤浓缩液、超滤透过液，检测其总蛋白含量；其中，当超滤透过液中总蛋白含量≤0.02mgml，则直接排弃透过液；超滤透过液总蛋白含量0.02mgml，则对超滤膜进行完整性测试，超滤膜未破损，则排弃透过液；若超滤膜破损，则更换超滤膜之后对透过液重复超滤；6冻干：将超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，按照冻干工艺条件，-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％，获得洋白蜡花粉变应原冻干品。13.根据权利要求1所述洋白蜡花粉变应原浸提物、权利要求2-6中任一项所述洋白蜡花粉变应原浸液及权利要求12所述洋白蜡花粉变应原冻干品的应用，用于在制备诊断变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗制剂中的应用，所述诊断变态反应疾病包括过敏性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和慢性荨麻疹。14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述洋白蜡花粉变应原浸提物冻干品用于制备成片剂、口崩片，所述洋白蜡花粉变应原浸液用于制备注射液、舌下滴剂、变应原斑贴剂、变应原浸液稀释液。

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