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申请/专利权人：兰州大学

摘要：本发明公开了一种利用PCR‑SSCP快速检测绵羊NELF基因单核苷酸多态性的方法及其应用。以待测绵羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增获得绵羊NELF基因片段，PCR产物经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，产生不同的泳动带。根据SSCP分型结果鉴定绵羊NELF基因第454位的单核苷酸多态性。本发明所述的方法能够快速的检测绵羊NELF基因的单核苷酸多态性，为NELF基因的SNP与繁殖性能关系的建立奠定基础，以便用于中国绵羊用繁殖性状的标记辅助选择育种提供基础资料，快速建立遗传资源优良的绵羊种群。

主权项：1.利用PCR-SSCP快速检测绵羊NELF基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：以待测绵羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增绵羊NELF基因片段，将PCR扩增的片段变性成单链DNA，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，根据凝胶电泳结果判定绵羊NELF基因上单核苷酸多态性位点的基因型；所述绵羊NELF基因的单核苷酸多态性为绵羊NELF基因第454位TC突变的单核苷酸多态性；建立基因型为TC的绵羊群体，提高绵羊的产羔数；所述的引物对P为：上游引物：5’-TTGCCCCTTTCGTTGCTC-3’下游引物：5’-TTTCTCCACTGTCACCGCC-3’。

全文数据：利用PCR-SSCP快速检测绵羊NELF基因单核苷酸多态性的方法及其应用技术领域本发明属于分子遗传学领域，涉及绵羊单核苷酸多态性SNP分子标记的筛选与检测，特别涉及利用PCR-SSCP方法快速检测NELF基因组第454位点单核苷酸多态性。具体来说，就是对PCR扩增获得的产物变性之后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后根据电泳结果确定其单核苷酸多态性。背景技术近20年来，尤其是近10年来，分子遗传学和分子生物技术有了突飞猛进的发展，其中，分子遗传标记是目前在家畜育种中研究得最多的内容，也是近期内最可能在家畜育种中得到广泛应用的研究项目。遗传标记是指那些可以准确鉴别的、能反映个体特异性的遗传特征。分子遗传标记则是指以个体遗传物质即核苷酸序列变异为基础的DNA分子标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。利用分子标记辅助选择育种，是现代动物分子育种的一项主要研究内容，其直接在DNA水平上对性状的基因型进行选择，因此其选种的准确性大大提高，克服了传统动物育种方法的缺陷。单核苷酸多态性SNP是一种重要的分子遗传标记，它是由美国学者Lander于1996年提出的第三代DNA遗传标记，是基因组中单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基的转换、插入及缺失等形式。PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。因此，可以通过PCR-SSCP技术检测基因组是否存在SNP位点，并且准确的鉴别SNP位点的基因型。现在已经公认单链构象多态性SSCP可作为遗传标记应用于育种中。该方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且检测序列位点无特殊要求。鼻胚胎促黄体激素释放激素因子NasalembryonicLHRHfactor，NELF编码基因与动物的生殖有密切关系。SamuelD.Quaynor等通过创建纯合NELF敲除KO小鼠模型，证明雌性小鼠NELF基因敲除将推迟阴道口开放，并没有延迟第一次发情的时间，减少了子宫重量并且减少了GnRH的神经元数目。与此相反，雄性小鼠的青春期表现正常。NELF敲除导致雌雄小鼠都表现为生育能力受损，平均窝产仔数降低。此外，越来越多的报道表明，NELF在小鼠的生殖方面有重要作用。绵羊的NELF基因定位在第20号染色体上，全长5928bp，编码区全长1112bp。目前，国内外对NELF基因多态性的研究主要集中于小鼠等模式动物，而对于家畜NELF基因单核苷酸多态性的研究尚未见报道。发明内容本发明的目的在于提供一种利用PCR-SSCP快速检测绵羊NELF基因单核苷酸多态性的方法及其应用，从而为绵羊的分子标记辅助选择育种提供基础资料，加快中国绵羊的种质资源改良工作。本发明是通过以下技术方案来实现的：以包含NELF基因的待测绵羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增绵羊NELF基因片段；对扩增片段进行变性，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据凝胶电泳结果判定绵羊NELF基因的单核苷酸多态性；所述的引物对P为：上游引物F：5’-TTGCCCCTTTCGTTGCTC-3’18nt；下游引物R：5’-TTTCTCCACTGTCACCGCC-3’19nt。所述的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，64℃退火50s，72℃延伸30s，34个循环；72℃延伸10min。根据聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳结果鉴定绵羊NELF基因accessionnumberNC_019477.2：g.454位的TC突变的多态性。根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定绵羊NELF基因组第454位存在TT、TC、CC三种基因型。所述的凝胶电泳为10-12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，先在4℃下，200-250V预电泳20-60min，再在室温下，120-150V电泳3-4h。本发明的有益效果体现在：针对绵羊NELF基因第454位TC的突变，本发明提供了其检测方法，通过设计特定的引物，PCR扩增目的片段，然后变性成单链DNA，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。该方法能够简单、快速、低成本、精确度高的鉴定基因的单核苷酸多态性。本发明对突变位点的基因型进行了检测和基因频率分析，并将该位点与绵羊的繁殖性状进行关联分析。结果表明该位点可作为分子遗传标记进行分子标记辅助选择育种，以提高绵羊繁殖性状。附图说明图1为绵羊NELF基因组第454位具有深色背景的位点TT基因型个体的测序图。图2为绵羊NELF基因组第454位CC基因型个体的测序图。图3为绵羊NELF基因组第454位TC基因型个体的测序图。图4为绵羊NELF基因组第454位不同基因型PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明做详细的说明，所述是对本发明的解释而不是限定。本发明根据绵羊NELF基因组序列设计引物，分别以2种绵羊品种的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，产物测序得到绵羊NELF基因的部分序列。与NCBI上公布的参考序列比对，发现在绵羊NELF基因组第454位存在TC的突变，该突变位点位于绵羊NELF基因内含子内，产生一个无意突变，并将其与繁殖性状进行关联分析，确定为与绵羊繁殖性状相关的分子遗传标记，利用PCR-SSCP方法对该突变进行检测。一、绵羊NELF基因部分序列的克隆及其多态性检测1.样本采集及基因组DNA提取⑴血样的采集本发明采用了2个绵羊品种，共计607个个体作为检测对象，血液的采集方法为颈静脉采血。血样的采集地区，以及各品种的数据资料情况如表1所示：表1实验动物情况⑵血样DNA的提取①冷冻血样主要为血细胞室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液PBS混匀，温和摇动，4℃，12000rmin离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈透明色。②在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。③加蛋白酶K至3μL20mgmL，并混匀，55℃水浴中消化过夜16h左右至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清。④将反应液冷却至室温，加入500μLTris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃，12000rmin离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管，重复上述步骤1次。⑤加入氯仿500mL，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃，12000rmin离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5mL离心管。⑥加入氯仿、异戊醇混合液24:1500mL，充分混合20min，4℃，12000rmin离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。⑦加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出。⑧4℃，12000rmin离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。⑨4℃，12000rmin离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。⑩干燥后的DNA溶液中加入80～100μL的超纯水溶解，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度仪检测其质量，-80℃保存。2.DNA池的构建用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260OD280的比值，DNA浓度ngμL＝50×OD260值×稀释倍数。如果OD260OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；如果比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ngμL，然后从2个绵羊群体中随机选择10个浓度为50ngμLDNA样品中取5μL混合构建DNA池。二、扩增引物设计1.绵羊NELF基因PCR引物的设计以NCBI所公布的绵羊序列NC_019477.2为参考，利用Primer5.0软件设计能够扩增包含绵羊NELF基因第454位点的PCR引物，其引物序列如下：上游引物F:5’-TTGCCCCTTTCGTTGCTC-3’18nt；下游引物R:5’-TTTCTCCACTGTCACCGCC-3’19nt。三、PCR扩增PCR反应体系如表2所示。表2PCR反应体系PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，64℃退火50s，72℃延伸30s，34个循环；72℃后延伸10min。四、PCR产物测序将用以上混合的DNA池为模板扩增的PCR产物送上海生工有限公司进行双向测序。对绵羊NELF基因目的片段测序结果与参考序列进行比对，发现在基因组的第454位存在一个TC的突变参见图1、图2以及图3。五、PCR产物变性及SSCP检测对于PCR扩增后的产物首先变性，然后进行聚丙烯酰胺凝胶检测，最终根据不同的带型结果判定其SNP多态性。具体步骤如下：1根据不同的扩增片段，选择30％丙烯酰胺29:1配成10％～12％的聚丙烯酰胺凝胶见表3。2加好上述溶液后，用玻璃棒慢慢搅动，使其充分混匀。立即缓慢倒入已准备好的底部密封的玻璃板之间，注意不要产生气泡；倒好凝胶后，立即插上梳子，切勿在梳子齿下留有气泡。3待胶凝固后，拔掉梳子，轻轻的甩干点样孔中的水分，然后将玻璃板固定到垂直电泳槽上，并往槽中倒入1×TBE缓冲液。4取8μLPCR产物，加入8μL变性缓冲液95％甲酰胺、10molLEDTA、0.05％溴酚兰、0.05％二甲苯青，瞬时离心后在PCR仪中98℃变性10min，取出后立即置于冰上，30min后即可上样。54℃、先250V预电泳20min，然后120V电泳4h根据扩增片段大小、凝胶浓度以及玻璃板的长度确定电压大小和电泳时间。6将电泳槽中的1×TBE缓冲液倒出回收，然后从玻璃板中取出凝胶，用蒸馏水漂洗2次后，加入适量的0.1％的硝酸银溶液，放于摇床避光轻轻摇15min硝酸银可回收利用2～3次。7加入显色液2％氢氧化钠+0.1％甲醛浸没凝胶，边摇边观察，直到凝胶上显现电泳带。8待条带清晰后，倒掉显色液，迅速用去离子水清洗2～3次。银染后的聚丙烯酰胺凝胶利用凝胶成像系统成像保存，留做后续的分析统计。表3中性聚丙烯酰胺凝胶的组成PCR-SSCP图片如图4所示。不同的带型表示不同的基因型。从图中可以看出NELF基因454位点存在三种基因型，即TT、TC、CC，其中，TT基因型和CC基因型均为两个条带，且TT基因型与CC基因型相比，远离上样端的条带距离上样端更远，TC基因型具有相应的三个条带。六、绵羊NELF基因SNP位点的频率统计及其与繁殖性状的关联分析1.基因和基因型频率基因型频率是指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。计算公式如下：PBB＝NBBN其中PBB代表某一位点的BB基因型频率；NBB表示群体中具有BB基因型的个体数；N为检测群体的总数量。基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。计算公式可写成：PB＝2NBB+NBb1+NBb2+NBb3+NBb4+……+NBbn2N式中，PB表示等位基因B频率，NBB表示群体中具有BB基因型的个体数量，NBbi表示群体中具有Bbi基因型个体数量，b1～bn为等位基因B的n个互不相同的复等位基因。各品种中的基因频率与基因型频率的统计结果如表4所示：表42个绵羊品种中NELF基因的基因型和等位基因频率从表3中可以看出等位基因T的频率变化范围为0.460～0.506，等位基因C的频率变化范围为0.494～0.500，由此可见，在2个绵羊品种中，对于等位基因C的选择具有很大的潜力。2.相关分析统计模型利用SAS9.2软件分析基因位点与繁殖性状产羔数的相关性。先对数据进行描述性统计分析，确定是否存在离群值，根据数据特征，利用t分析、方差分析或是多元线性模型分析基因型效应。在数据处理中，根据影响产羔数因素不同，考虑到环境效应、年龄、基因型效应及相关的互作效应，采用固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整的模型如下：Yijk＝μ+Gj+Eijk其中：Yijk为个体表型记录；μ为群体均值；Gj为各位点的基因型效应；Eijk为随机误差。表5NELF基因单核苷酸多态性与绵羊繁殖性状之间的方差分析注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著P0.05，平均值肩标上字母不同表示差异显著P兰州大学利用PCR-SSCP快速检测绵羊NELF基因单核苷酸多态性的方法及其应用2118DNA人工合成1ttgcccctttcgttgctc18219DNA人工合成2tttctccactgtcaccgcc19

权利要求：1.利用PCR-SSCP快速检测绵羊NELF基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：以待测绵羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增绵羊NELF基因片段，将PCR扩增的片段变性成单链DNA，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，根据凝胶电泳结果判定绵羊NELF基因上单核苷酸多态性位点的基因型；所述绵羊NELF基因的单核苷酸多态性为绵羊NELF基因第454位TC突变的单核苷酸多态性；建立基因型为TC的绵羊群体，提高绵羊的产羔数；所述的引物对P为：上游引物：5’-TTGCCCCTTTCGTTGCTC-3’下游引物：5’-TTTCTCCACTGTCACCGCC-3’。2.如权利要求1所述的利用PCR-SSCP快速检测绵羊NELF基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，64℃退火50s，72℃延伸30s，34个循环；72℃延伸10min。3.如权利要求1所述的利用PCR-SSCP快速检测绵羊NELF基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度为10-12％。4.如权利要求1所述的利用PCR-SSCP快速检测绵羊NELF基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝胶电泳的条件包括：先于200-250V预电泳20-60min，再于120-150V电泳3-4h。5.如权利要求1所述的利用PCR-SSCP快速检测绵羊NELF基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述绵羊NELF基因的单核苷酸多态性表现为TT、TC以及CC三种基因型，电泳结果分别为：TC基因型具有三个条带，TT和CC基因型具有两个条带。6.如权利要求1所述的利用PCR-SSCP快速检测绵羊NELF基因单核苷酸多态性的方法在绵羊分子育种中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述绵羊选自湖羊。

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