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申请/专利权人：中国农业大学

摘要：本发明涉及簇毛麦NAM‑V1基因及其分子标记和应用。本发明提供的来源于簇毛麦V染色体组的NAM‑V1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。基因NAM‑V1在小麦籽粒蛋白质积累方面发挥重要作用，并和小麦抗白粉病基因Pm21共分离，NAM‑V1基因在高蛋白质和抗白粉病小麦新品种培育中具有潜在的应用价值。另外，本发明还提供用于特异检测NAM‑V1基因的分子标记CauNAM‑V1及其应用，该标记能够特异检测小麦品种中是否存在NAM‑V1基因，还可以检测小麦材料中是否含有抗白粉病基因Pm21，可同时用作小麦高蛋白和抗白粉病筛选的分子标记。

主权项：1.簇毛麦NAM-V1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

全文数据：簇毛麦NAM-V1基因及其分子标记和应用技术领域本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及簇毛麦NAM-V1基因及其分子标记和应用。背景技术小麦目前是全球第一大粮食作物，全世界约有35％～40％的人口将其作为主要的食物来源，约占全球卡路里消费总量的20％，全球小麦年产量7亿吨左右，提供约7000万吨的蛋白质。因此，增加小麦籽粒的蛋白含量不仅能够改良小麦的品质，而且有助于大幅度提高食用蛋白质的总量。小麦籽粒蛋白含量grainproteinconcentration，GPC及其组成决定着小麦的加工品质和营养品质。小麦的籽粒蛋白含量是典型的数量性状，而且容易受到环境条件的影响Groosetal.,2003。2006年，Uauy等通过图位克隆获得了控制蛋白含量的基因NAM-B1，该基因位于小麦6BS染色体上，编码一种NAC转录因子Uauyetal.,2006。簇毛麦Haynaldiavillosa，2n＝2x＝14，V基因组属小麦族，为一年生或多年生异株授粉二倍体植物。簇毛麦基因耐寒、分蘖力强、抗病、耐盐、抗旱和籽粒蛋白含量高等优良特性，是小麦遗传改良的重要基因资源2006。小麦-簇毛麦易位系是利用簇毛麦优异基因资源的重要途径，例如，6VS·6AL易位系携带抗白粉病基因Pm21，对小麦白粉病表现抗性强、抗谱广，育成的品种累计推广面积达到340万公顷Caoetal.,2011。除了抗白粉病基因，在簇毛麦6VS染色体上还定位了副硫α-醇溶蛋白Sulfur-richa-prolamins基因Gli-V2、抗条锈Striperust基因Yr26等优异性状Blancoetal.,1991；Maetal.,2001。但是目前还没有簇毛麦中控制籽粒蛋白含量性状的基因报道。白粉病是一种严重影响小麦产量和品质的世界性病害，在各国小麦产区均有发生。近二十年来，小麦白粉病发生的范围和面积不断扩大，危害程度日益加重，目前，小麦白粉病已成为影响小麦产量的重要限制因素。小麦白粉病的病原菌为禾本科布氏白粉菌小麦专化型，属子囊菌亚门真菌，该病菌具有多个生理小种，在不同地理生态环境中与寄主互作过程中变异速度快，目前一些大面积生产应用的品种已经或正在丧失抗性，因此白粉病害处于随时大面积流行的严重态势。农药防治对防控白粉病起到了一定的作用，但是会耗费大量的人力和财力资源，不利用生态环境。利用现代生物技术，不断鉴定和挖掘小麦中的抗白粉病基因或QTL位点，将抗白粉病基因或QTL位点通过分子基因工程或分子标记辅助选择培育和推广抗病品种，是防治小麦白粉病最为安全、经济和有效的途径。目前已经鉴定的小麦抗白粉病基因位点有70多个，随着这些基因在小麦育种上的应用和推广，病原菌的生理小种也发生了很大的变化。目前大部分的抗白粉病已经失去了抗性。抗白粉病基因Pm21来源于簇毛麦，Pm21抗国内所有的白粉病菌株及检测过的120个欧洲生理小种，是目前世界上抗谱最广、抗性最稳定的抗白粉病基因Caoetal.,2011，因此，开发与Pm21连锁的分子标记对于小麦抗白粉病抗病育种具有重要意义。目前，在现有文献中小麦抗白粉病基因Pm21的分子标记报道较少，而且大部分Pm21的分子标记是基于SDS-PAGE电泳的标记，使用不方便，限制了抗白粉病基因Pm21在小麦抗病育种中的应用。发明内容本发明的目的是提供簇毛麦NAM-V1基因，以及NAM-V1基因在增加小麦籽粒蛋白质含量中的作用，并且证明在小麦中该基因与抗白粉病基因Pm21共分离。本发明的另一目的是提供簇毛麦NAM-V1基因分子标记CauNAM-V1及其应用，利用该标记特异检测小麦品种中是否存在NAM-V1基因，还用于检测小麦材料中是否含有抗白粉病基因Pm21，同时用作小麦高蛋白和抗白粉病筛选的分子标记。为了实现本发明目的，本发明提供的簇毛麦NAM-V1基因，其为控制小麦籽粒蛋白质含量的基因，利用该基因可提高小麦籽粒的蛋白含量。簇毛麦NAM-V1基因的核苷酸序列为：iSEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或iiSEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv与i、ii或iii的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。本发明还提供由上述簇毛麦NAM-V1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明还提供含有所述簇毛麦NAM-V1基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。本发明还提供所述簇毛麦NAM-V1基因，含有所述NAM-V1基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在提高作物蛋白含量中的应用。本发明中涉及的作物包括但不限于小麦、大麦、黑麦、燕麦、簇毛麦。携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中Weissbach，1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，PlantMolecularBiology，2ndEdition。例如，可将含有所述NAM-V1基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系通过农杆菌介导、花粉管导入或基因枪的方法转入作物中，培育高籽粒蛋白含量的转基因作物。本发明还提供所述簇毛麦NAM-V1基因的分子标记CauNAM-V1，用于特异性PCR扩增该分子标记的引物为：正向引物F5'-TCCCCGGTATGCCATGTC-3'和反向引物R5'-AAGATACCGCTAGACCGTGA-3'。本发明还提供所述分子标记CauNAM-V1在检测作物中NAM-V1基因和或Pm21基因中的应用，本发明还提供所述分子标记CauNAM-V1在小麦高蛋白含量和或抗白粉病的分子标记辅助育种中的应用。本发明还提供所述分子标记CauNAM-V1在筛选和鉴定兼具高蛋白含量和抗白粉病的小麦新品种中的应用。本发明还提供用于检测作物中NAM-V1基因和或Pm21基因的引物，包括正向引物F5'-TCCCCGGTATGCCATGTC-3'和反向引物R5'-AAGATACCGCTAGACCGTGA-3'。本发明进一步提供含有所述引物F和R的检测试剂盒。本发明从簇毛麦V染色体中克隆获得一个小麦NAM家族基因，命名为NAM-V1，该基因全长1528bp，具有完整的开放阅读框，包括3个外显子和2个内含子，在小麦6VS·6AL易位系中NAM-V1基因替换NAM-A1基因后提高了籽粒蛋白的含量，说明NAM-V1基因能够提高小麦籽粒的蛋白质含量。根据NAM-V1基因的核苷酸序列，开发出特异检测NAM-V1基因的分子标记CauNAM-V1，在小麦6VS·6AL易位系的分离群体中证明该标记和小麦抗白粉病基因Pm21共分离，证明该标记可同时检测NAM-V1基因和Pm21基因。因此，利用NAM-V1基因能够提高小麦籽粒的蛋白含量。利用CauNAM-V1标记能同时检测小麦的抗白粉病基因Pm21，该标用于小麦的分子育种，能够筛选和获得兼具高蛋白和抗白粉病的小麦新品种。本发明具有以下优点：一小麦是世界上最重要的粮食作物之一，全球小麦年产量约7亿吨，如果小麦籽粒蛋白含量增加1％，相当于全球小麦蛋白含量增加700万吨。本发明的NAM-V1基因对小麦籽粒蛋白质含量的贡献率最高超过了1％，因此，NAM-V1基因对于增加全球的食用蛋白质供应具有重要意义。二小麦抗白粉病基因Pm21是目前世界上抗谱最广、抗性最稳定的抗白粉病基因，此前开发的抗白粉病基因Pm21的标记大多是基于SDS-PAGE电泳技术的标记，操作过程中制胶、染色步骤复杂，并且丙烯酰胺、TEMED等对人体具有很高的毒性。本发明的CauNAM-V1标记是基于琼脂糖电泳的标记，检测方法较为简单，可使用新型的核酸染料进行染色，更加安全、实用。对于充分利用Pm21抗白粉病基因资源，促进小麦抗病育种具有重要意义。三本发明提供的CauNAM-V1标记可同时检测控制小麦籽粒蛋白含量的基因NAM-V1和抗白粉病基因Pm21，即一个标记同时选择两种性状，对于提高小麦分子育种的效率，实现多性状的聚合育种具有重要的意义。附图说明图1为本发明实施例1中对克隆获得的簇毛麦NAM-V1基因的电泳检测结果以及基因结构分析结果；其中，a：NAM-V1基因组和cDNA的克隆；b：NAM-V1基因结构分析；c：NAM-V1基因保守域预测。图2为本发明实施例2中构建的簇毛麦NAM-V1基因的系统进化树；其中，物种缩写：山羊草Aet，硬粒小麦Tt，大麦Hv，水稻Os，拟南芥At，提莫非维小麦G。图3为本发明实施例3中NAM家族基因序列比对结果及CauNAM-V1分子标记的位置。图4为本发明实施例4中分子标记CauNAM-V1在不同小麦品种中的扩增情况。图5为本发明实施例5中小麦抗白粉病基因Pm21分离群体的表型分析结果。图6为本发明实施例5中分子标记CauNAM-V1在小麦Pm21分离群体中的扩增情况。图7为本发明实施例6中NAM-V1基因调控小麦籽粒蛋白含量的效果。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件；所用原料均为市售商品。实施例1簇毛麦NAM-V1基因的克隆根据NCBI上公布的NAM-A1DQ869672、NAM-D1DQ869675、NAM-B1DQ869673、NAM-B2DQ869676、NAM-D2DQ869677基因的序列信息，设计两对克隆NAM基因完整编码区的引物NAMORF1和NAMORF2，正向引物包括起始密码子，反向引物包括终止密码子。分别以簇毛麦的基因组DNA和cDNA为模板，用引物对NAMORF1和NAMORF2进行PCR扩增。PCR反应体系为：模板DNA3μl，正、反向引物各1μl，dNTP10mM0.4μl，高保真TaqDNA聚合酶5Uμl0.2ul，10×PCR反应缓冲液2μl，加ddH2O补足20μl后混匀。PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，共33个循环；72℃7min，16℃结束反应。PCR反应结束后，以1％琼脂糖电泳检测扩增结果。电泳结果表明，从基因组DNA和cDNA中分别扩增得到了长度为1.5kb和1.2kb左右的目的条带图1a。将目的条带回收后连接到pMD18-T载体，转化大肠杆菌感受态细胞。切胶回收目的DNA，连接到克隆载体pMD18-T上进行DNA序列的测定。将测序结果和NCBI中已知基因蛋白进行BlastNBlastXP比对分析，结果表明该基因编码NAC转录因子，是已报道的野生二粒小麦的NAM-B1基因，普通小麦的NAM-A1、D1、D2、B2的同源基因，但序列差别较大，由于来源于簇毛麦的V染色组，因此命名为NAM-V1基因。NAM-V1基因全长1528bp，包括3个外显子和2个内含子图1b。开放阅读框全长1224bp，编码407个氨基酸，预测分子量为43kDa，等电点为8.39。NCBI的CDD预测表明NAM-V1蛋白的N端编码一个NAM_superfamily的保守结构域图1c。表1引物序列信息实施例2簇毛麦NAM-V1基因的遗传进化分析利用比对软件ClustalW1.83对簇毛麦的NAM-V1和小麦、拟南芥、水稻等植物的NAC蛋白进行多序列同源比对，输出的文件通过BOXSHADE3.21进行着色。采用Mega4软件中的邻位相连法Neighbor-joining构建系统进化树。对簇毛麦NAM-V1的编码蛋白与其他物种中同源NAC蛋白进行系统进化树分析，结果如图2所示。不同来源的NAC蛋白分成了4类Group。其中簇毛麦NAM-V1属于GroupI，GroupI还包括水稻的NAC4，硬粒小麦的TtNAM-B16B染色体、TtNAM-B22B染色体和TtNAM-A16A染色体，山羊草的AetNAM-D22D染色体和AetNAM-D16D染色体，大麦的NAM-1和NAM-2H基因组，提莫非维小麦的NAM-GG基因组。其中来源于簇毛麦的NAM-V1和来源于小麦A、D、B亚基因组的第6号染色体的TtNAM-A1、AetNAM-D1和TtNAM-B1亲缘关系最近，其次为来源于小麦A、D、B亚基因组的第2号染色体TtNAM-B2、AetNAM-D2。这表明一方面，NAM-V1可能与NAM-B1、A1、D1、B2、D2具有相同的生物学功能，即提高籽粒中蛋白质、铁、锌的含量。另一方面，来源于B和D亚基因组第2号染色体的TtNAM-B2、AetNAM-D2是来源于第6号染色体NAM-B1、A1和D1的旁系同源基因，可能来源于一次基因复制事件Geneduplicationevents。根据小麦族植物的遗传进化模型，预测这一基因复制事件可能发生在A基因组祖先种和BSD基因组祖先种分离之后，BS基因组祖先种和D基因组祖先种分离之前，即大约在5.8±1MYA到2.6±0.8MYA之间；在GroupII中只有3个基因，都来自拟南芥，分别是AtNAC2、AtNAC18和AtNAC20。其中AtNAC2相应盐胁迫，并且和侧根发育相关；GroupIII中包含3个基因，分别是水稻的OsABA91266、OsABA95705和小麦的TaNAC69。TaNAC69相应低温、干旱和盐胁迫，与小麦逆境下的适应性相关；GroupIV中包含3个基因，分别是小麦的TaNAC2、水稻的OsNP912423和拟南芥的AtNAC3，其中TaNAC2和AtNAC3也与植物抗逆相关。实施例3簇毛麦NAM-V1基因的序列比对和分子标记开发基因NAM-V1和NAM-A1、NAM-B1、NAM-B2、NAM-D1、NAM-D2的核苷酸序列比对结果表明，在NAM-V1第247个碱基的位置有一个“ATGTC”的插入，在第785个碱基处有一个“GT”的SNP差异。根据这两个位点的侧翼序列，设计出用于特异检测NAM-V1基因的标记CauNAM-V1图3。用于特异性PCR扩增标记CauNAM-V1的引物见表1。实施例4利用分子标记CauNAM-V1检测不同小麦材料中的NAM-V1基因为了检测CauNAM-V1引物的特异性，同时也为了证明NAM-V1来源于簇毛麦的6VS染色体，分别在中国春CS、粗山羊草Aegilopstauschii、乌拉尔图小麦T.urartu、栽培一粒小麦T.mononcoccum、中国春小麦缺体四体系2B2D和6A6B、Pm12、Pm21感病单株和Pm21抗病单株中进行扩增。结果显示，在含6V染色体短臂的Pm21抗病单株6VS·6AL易位系中能扩增出与预期大小相同的特异目的条带，而在其他供试材料中均未扩增到相应的特异条带。证明CauNAM-V1引物能够特异性的检测NAM-V1基因的存在。该结果也证明了NAM-V1基因来源于簇毛麦的6VS染色体图4。实施例5分子标记CauNAM-V1在检测小麦Pm21抗病基因中的应用构建小麦6VS·6AL易位系的分离群体，对分离群体的后代单株经白粉病菌生理小种E09感染后进行抗病性鉴定，抗病表型如图5所示。挑选10个抗病单株和10感病单株，进行CauNAM-V1标记的PCR扩增，扩增结果表明，CauNAM-V1标记呈现出抗白粉病特性共分离的现象，即在所有供试的抗病单株中均能检测到特异性的目的条带，而在所有供试感病单株中均没有检测到相应的目的条带图6。结果证实了CauNAM-V1是可以作为Pm21抗病基因检测的分子标记。实施例6NAM-V1基因在增加小麦籽粒蛋白含量中的应用为了证明簇毛麦NAM-V1基因在小麦籽粒蛋白质含量中的作用，利用小麦6VS·6AL易位系，构建了NAM-V1基因的4个分离群体，分别是W50200、W50175、W50156和W50176。然后用CauNAM-V1标记分别检测了分离群体后代的基因型，并且单株测定了小麦籽粒的蛋白质含量图7。结果表明，在含有NAM-V1基因和不含NAM-V1基因的情况下，在4个分离群体中的籽粒蛋白含量分别为13.94％13.42％、17.99％16.88％、13.33％13.31％、15.41％14.33％，结果表明含有NAM-V1基因的后代材料中的籽粒蛋白质含量均有所增加，其中在W50175和W50176分离群体中籽粒蛋白含量分别增加了1.11％和1.08％。以上结果表明，簇毛麦的NAM-V1基因能够提高小麦籽粒的蛋白质含量。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。参考文献1、Groos,C.,Robert,N.,Bervas,E.andCharmet,G.2003Geneticanalysisofgrainprotein-content,grainyieldandthousand-kernelweightinbreadwheat.TheorApplGenet,106,1032-1040.2、Cao,A.,Xing,L.,Wang,X.,Yang,X.,Wang,W.,Sun,Y.,Qian,C.,Ni,J.,Chen,Y.andLiu,D.2011SerinethreoninekinasegeneStpk-V,akeymemberofpowderymildewresistancegenePm21,conferspowderymildewresistanceinwheat.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,108,7727-7732.3、Uauy,C.,Distelfeld,A.,Fahima,T.,Blechl,A.andDubcovsky,J.2006ANACGeneRegulatingSenescenceImprovesGrainProtein,Zinc,andIronContentinWheat.Science,314,1298-1301.4、A.2006ThegenusDasypyrum––part1.ThetaxonomyandrelationshipswithinDasypyrumandwithTriticeaespecies.Euphytica,152,429-440.5、Blanco,A.,Resta,P.,Simeone,R.,Parmar,S.,Shewry,P.R.,Sabelli,P.andLafiandra,D.1991ChromosomallocationofseedstorageproteingenesinthegenomeofDasypyrumvillosumL.Candargy.TheoreticalandAppliedGenetics,82,358-362.6、Ma,J.,Zhou,R.,Dong,Y.,Wang,L.,Wang,X.andJia,J.2001MolecularmappinganddetectionoftheyellowrustresistancegeneYr26inwheattransferredfromTriticumturgidumL.usingmicrosatellitemarkers.Euphytica,120,219-226.

权利要求：1.簇毛麦NAM-V1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。2.含有权利要求1所述簇毛麦NAM-V1基因的表达盒、重组载体或重组菌。3.权利要求1所述簇毛麦NAM-V1基因，或权利要求2所述表达盒、重组载体或重组菌在提高作物蛋白含量中的应用，所述作物为小麦、大麦、黑麦、燕麦或簇毛麦。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将权利要求2所述的表达盒、重组载体或重组菌，通过农杆菌介导、花粉管导入或基因枪的方法转入作物中，培育高籽粒蛋白含量的转基因作物。5.权利要求1所述簇毛麦NAM-V1基因的分子标记CauNAM-V1，其特征在于，用于特异性PCR扩增该分子标记的引物为：正向引物F5'-TCCCCGGTATGCCATGTC-3'和反向引物R5'-AAGATACCGCTAGACCGTGA-3'。6.权利要求5所述分子标记在检测作物中NAM-V1基因和或Pm21基因中的应用，所述作物为小麦、大麦、黑麦、燕麦或簇毛麦。7.权利要求5所述分子标记在小麦高蛋白含量和或抗白粉病的分子标记辅助育种中的应用。8.权利要求5所述分子标记在筛选或鉴定高蛋白含量和或抗白粉病小麦品种中的应用。9.用于检测作物中NAM-V1基因和或Pm21基因的引物，所述作物为小麦、大麦、黑麦、燕麦或簇毛麦，其特征在于，包括正向引物F5'-TCCCCGGTATGCCATGTC-3'和反向引物R5'-AAGATACCGCTAGACCGTGA-3'。

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