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申请/专利权人：常州大学;河北慈心环保科技有限公司;江苏碧奥环保科技有限公司

摘要：本发明公开了一种油脂降解菌KosakoniacowaniIUMRB67及其应用，属于生物技术领域。实验证明，本发明的油脂降解菌IUMRB67可以在油脂为唯一碳源的环境中存活，具有很高的油脂降解活性。本发明所提供的油脂降解菌IUMRB67可以应用于污染环境中的油脂降解，在餐厨垃圾处理和环境修复方面具有很好的应用价值。

主权项：1.一株油脂降解菌，其特征在于，该油脂降解菌为考氏科萨克氏菌Kosakoniacowanii，其中该油脂降解菌编号：IUMRB67，保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO.18023。

全文数据：一株油脂降解菌KosakoniacowaniiIUMRB67的分离及应用技术领域本发明属于生物技术领域，具体为一种油脂降解菌及其对餐厨垃圾或废水油脂降解领域的应用。背景技术随着城市人口的增加和生活质量的提高，餐厨垃圾的总量以及油脂含量也相应的不断增加，由于餐厨垃圾营养丰富，处理不当极易腐烂变质，进而污染环境、危害人类健康。餐厨垃圾废弃油脂含有大量病原菌和毒素，未经处理直接去喂猪等牲畜，容易将病原菌和毒素传播给人；废弃油脂被不法分子加工成“地沟油”流入市场危害人类健康；此外，废弃油脂进入土壤后，使土壤的透气性和渗水性降低，阻碍植物根系的吸收与呼吸，引起根系腐烂，进而导致死亡；而排入水体的油脂会造成水体溶氧不足，严重影响水体的生态环境。因此，为了避免餐厨垃圾中废弃油脂引起的环境污染和食品安全等问题，如何有效处理废弃油脂成为国内外学者研究的难点和热点。当前处理废油脂的方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法和化学法占地大，投资大，易二次污染。生物法处理油脂废水则是微生物利用油脂作为生长所需的碳源，在酶的催化下将油脂水解为甘油和脂肪酸，最后降解为二氧化碳和水等代谢产物。相比之下，生物法处理成本低，无二次污染，是具有良好发展前景的油脂处理方法。而迄今为止，大部分研究工作集中于油脂废水的微生物分离和应用，而针对降解餐厨垃圾中油脂的研究报道较少。在餐厨垃圾生物处理过程中，油类物质会阻碍氧和电子的传导，导致微生物代谢紊乱，严重影响餐厨垃圾转换效率。因此，本研究将分离筛选具有高效降解油脂的微生物，并应用于餐厨垃圾处理，不仅消除了城市油脂污染、净化环境，同时也阻断了“地沟油”、“泔水猪”产生的源头，具有十分重要的现实意义。自然界中含有丰富的微生物资源，因其种类多、分布广、繁殖快、易变异、有很强的生化适应能力、对各类人工合成农药能较快产生适应酶系。不同的微生物有着不同的降解酶系来降解废弃油脂等污染物。微生物将油脂作为其生长所需的碳源和能源，并在酶的作用下水解成甘油和长链脂肪酸，最终降解为H2O和CO2等代谢产物，且具有成本低，无二次污染优点。而环境可降解农药的微生物种类也非常丰富，包括细菌、真菌、藻类等。但是油脂的降解菌株很少有报道，需要我们进行进一步进行研究，对消除环境中废弃油脂的污染、缩短餐厨垃圾发酵周期、净化环境有着重大的现实意义。发明内容本发明的目的在于提供一种油脂降解菌，及其对餐厨垃圾和废水油脂降解等方面的应用。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种油脂降解菌IUMRB67；其中油脂降解菌IUMRB67已于2019年6月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo:18023，分类命名为考氏科萨克氏菌Kosakoniacowani。上述诉油脂降解菌，对被油脂污染的环境具有修复作用，尤其对被餐厨垃圾中废弃油脂污染的环境，以及被餐厨废水中的油脂污染的水体，具有修复作用。上诉油脂降解菌对餐厨垃圾中的废弃油脂具有降解作用，对餐厨废水中所含的油脂具有降解作用，可直接应用于餐厨垃圾的净化处理领域。上述的该油脂降解菌的筛选方法，步骤如下：1从餐馆垃圾桶中称取污泥，加入油脂降解菌筛选液体培养基进行富集，在35-40℃、150-200rmin恒温摇床中培养4-10天；2吸取步骤1中所得的培养基加入新的油脂降解菌筛选液体培养基进行传代，如此传代3-6次；3取步骤2中所得菌液在LB平板上划线分离，得到油脂降解菌IUMRB67；其中油脂降解菌筛选培养基成分为：每1L去离子水中含有大豆油20mL，硫酸铵2g，磷酸二氢钾KH2PO40.5g，七水合硫酸镁MgSO4·7H2O0.2g，磷酸氢二钾K2HPO41.5g，氯化钠1g，pH7.0-7.2；LB固体培养基成分为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，以去离子水补足体积至1L。上述油脂降解菌的优选筛选方法，步骤如下：1从餐馆垃圾桶中称取污泥5克，加入100mL油脂降解菌筛选液体培养基进行富集，在37℃、180rmin恒温摇床中培养5-7天；2吸取步骤1中所得的培养基3mL加入新的油脂降解菌筛选液体培养基进行传代，如此传代4-5次；3取步骤2中所得菌液在LB平板上划线分离，得到油脂降解菌IUMRB67；上述油脂降解菌IUMRB67的干粉剂，为用使用扩大培养后的油脂降解菌IUMRB67培养物，经过常规方法干燥而成。所述油脂降解菌IUMRB67是按照如下所述方法筛选获得：一、从江苏常州武进区餐馆垃圾桶污泥中分离菌株，称取污泥5克，加入100mL油脂降解菌筛选液体培养基进行富集，在37℃、180rmin恒温摇床中培养5-7天；然后吸取培养基3mL加入新的油脂降解菌筛选液体培养基进行传代，如此传代4-5次，在LB平板上划线分离，经过上百次分离试验筛选，最终得到一株能在油脂作为唯一碳源的培养基中生存的菌种；所述油脂降解菌筛选培养基成分为：每1L去离子水中含有大豆油20mL,硫酸铵2g，磷酸二氢钾KH2PO40.5g，七水合硫酸镁MgSO4·7H2O0.2g，磷酸氢二钾K2HPO41.5g，氯化钠1g，pH7.0-7.2；所述LB固体培养基成分为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，以去离子水补足体积至1L。二、分析分离得到的不同菌种对培养基中大豆油的降解效率，筛选获得油脂降解效果最佳的菌株。具体测定方法如下：1、培养基制备基础盐培养基：KH2PO40.5g，K2HPO41.5g，NaCl1.0g，NH42SO42.0g，MgSO4·7H2O0.2g，去离子水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min。LB液体培养基：酵母粉5g，氯化钠10g，蛋白胨10g，去离子水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min。2、油脂降解效率测定方法2.1大豆油标准曲线的绘制精确称取0.1g精制大豆油于25mL容量瓶中，用石油醚定容至标线，制备成每毫升含0.1g25mL石油醚大豆油的标准溶液。然后向9个25mL的容量瓶中，分别加入0.0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07和0.1g的大豆油标准溶液，用石油醚定容至标线，配制成浓度梯度为0.0、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0和25.0mgmL大豆油溶液作大豆油标准曲线。在225nm波长下，以纯石油醚作为参比，分别测量上述系列浓度的大豆油溶液的吸光值。根据得到的数据绘制出大豆油标准溶液的标准曲线。2.2油脂降解率测定方法培养液加50％硫酸铵溶液去除蛋白质后，4000rpm离心10min，上清液移入分液漏斗中，加50％硫酸5ml酸化。将10mL石油醚移入分液漏斗，并充分振荡3min，静置使之分层，将水层移入采样瓶中，将石油醚移入25ml容量瓶里，再将水层移回分液漏斗内，用5ml石油醚重复萃取一次，静置分层后将石油醚层移入25mL容量瓶，与第一次萃取液混合，用石油醚定容至25ml。在波长225nm条件下测定吸光度，利用大豆油标准曲线所建立的线性回归方程计算出油脂浓度，所有实验均设置三个重复。2.3通过油脂降解菌对豆油的降解率，得出最优菌种将油脂降解菌菌株在LB液体培养基中培养，离心收集菌体，用无菌水重悬，并稀释至OD600＝1，将所选菌株接种1mL到100.0mL含100μL吐温80和1mL豆油的基础液体无机盐培养基中，置于恒温摇床中180rmin，37℃培养，分别在72h和144h测定降解率。其中，筛选得到油脂降解菌IUMRB67，其72h和144h对大豆油的降解率分别为：71.8％和95.8％；油脂降解效率果明显。2.4油脂降解菌IUMRB67对餐厨垃圾中的废弃油脂的降解将油脂降解菌IUMRB67按1％的接种量接种于100克灭菌的餐馆剩饭垃圾中，经测定，餐厨垃圾中的含油量为6％，于37℃、180rmin条件下培养72h，测定降解率为：19.25％。2.5油脂降解菌IUMRB67对废水中的废弃油脂的降解将油脂降解菌IUMRB67按1％的接种量接种于100mL灭菌的含油脂的废水中，经测定该废水的含油量为0.8％，于37℃、180rmin条件下培养72h，测定油脂降解率为：33.33％。菌株鉴定采用振荡破碎法获得油脂降解菌IUMRB67基因组DNA，通过PCR方法对菌株16SrRNA基因进行扩增并送至上海捷瑞生物公司进行测序分析；用于扩增16SrRNA基因的上游引物序列为：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’，下游引物序列为5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’。PCR反应条件是：95℃预变性10min，95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，反应31个循环，72℃延伸5min。使用NCBI的BLAST功能在GeneBank数据库中进行序列比对，分析菌株的分类为：考氏科萨克氏菌Kosakoniacowanii油脂降解菌IUMRB6716SrRNA基因序列见序列表。本发明的有益效果为：1、筛选出一种可以在油脂为唯一碳源的环境中存活的油脂降解菌IUMRB67，经降解分析表明，该菌株可以在20mLL油脂筛选固体培养基和液体培养基中生长良好，具有很高的油脂降解特性。2、该油脂降解菌IUMRB67将在餐厨垃圾中油脂降解、水体污染油脂的降解、土壤中废弃油脂的降解和环境污染修复中具有应用前景。3、本发明油脂降解菌的应用，有利于避免因物理或化学方法降解油脂而造成的二次污染。附图说明图1为该油脂降解菌IUMRB67单菌落形态图具体实施方式油脂降解菌IUMRB67的筛选过程一、主要材料1、培养基每1L的油脂筛选液体培养基成分：分别加入豆油20mL，硫酸铵2g，磷酸二氢钾KH2PO40.5g，七水合硫酸镁MgSO4·7H2O0.2g，磷酸氢二钾K2HPO41.5g，氯化钠1g，配制的液体培养基用HCl或者NaOH调节pH为7.0-7.2，然后再加入去离子水补足至1L。相对应的固体培养基则在1L液体培养基中添加琼脂粉15g配制成。每1L的LB液体培养基成分：分别加入蛋白胨10克，酵母粉5克，NaCl10克，配制的液体培养基用HCl或者NaOH调节pH为7.0-7.2，然后再加入去离子水补足至1L。相对应的LB固体培养基则在1L液体培养基中添加琼脂粉15g配制成。2、仪器设备FlexCyclerPCR扩增仪，Tanon-3500凝胶成像系统，北京市六一仪器厂电泳仪，灭菌锅，英衡电子天平，UV1900紫外可见分光光度计，恒温培养箱，eppendorf高速冷冻离心机，摇床，青岛海尔集团的低温冰箱二、油脂降解菌的筛选过程1从江苏常州武进区餐馆垃圾桶污泥中分离菌株，称取污泥5克，加入100mL油脂降解菌筛选液体培养基进行富集，在37℃、180rmin恒温摇床中培养5-7天；然后吸取培养基3mL加入新的油脂降解菌筛选液体培养基进行传代，如此传代4次；在LB平板上划线分离，得到油脂降解菌IUMRB67；所述油脂降解菌筛选培养基成分为：每1L去离子水中含有大豆油2mL,硫酸铵2g，磷酸二氢钾KH2PO40.5g，七水合硫酸镁MgSO4·7H2O0.2g，磷酸氢二钾K2HPO41.5g，氯化钠1g，pH7.0-7.2；所述LB固体培养基成分为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，以去离子水补足体积至1L。2将培养物在LB平板上划线分离，置于37℃恒温培养箱中培养12-26小时，获得油脂降解菌株IUMRB67单菌落形态图见图1；下面为具体实施例部分。实施例1将油脂降解菌IUMRB67在LB液体培养基中培养，离心收集菌体，用无菌水重悬，并稀释至OD600＝1，将所选菌株接种1mL到100.0mL含100μL吐温80和1mL豆油的基础液体无机盐培养基中，置于恒温摇床中180rmin，37℃培养，其72h和144h对大豆油的降解率分别为：71.2％和95.5％；油脂降解效率果明显。实施例2将油脂降解菌IUMRB67按1％的接种量接种于100克灭菌的餐馆剩饭垃圾中，经测定，餐厨垃圾中的含含油量为6％，于37℃、180rmin条件下培养72h，测定油脂降解率为：19.25％。实施例3将油脂降解菌IUMRB67按1％的接种量接种于100mL灭菌的含油脂的废水中，经测定该废水的含油量为0.8％，于37℃、180rmin条件下培养72h，测定油脂降解率为：33.33％。实施例4将油脂降解菌IUMRB67按1％的接种量接种于100g灭菌的含油脂0.65％的土壤中，于37℃恒温培养箱分别培养72h，测定油脂降解率为16.07％。实施例5油脂降解菌IUMRB67干粉剂的制备，油脂降解菌IUMRB67扩大培养后，经过常规方法干燥制得。序列表常州大学河北慈心环保科技有限公司江苏碧奥环保科技有限公司一株油脂降解菌KosakoniacowaniiIUMRB67及应用671SIPOSequenceListing1.011506DNA考氏科萨克氏菌Kosakoniacowanii1cttagagtttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcg60aacggtaacaggaagcagcttgctgctttgctgacgagtggcggacgggtgagtaatgtc120tgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataatg180tcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggat240tagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggat300gaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaa360tattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgg420gttgtaaagtactttcagcggggaggaaggcgatgtggttaataaccgcgtcgattgacg480ttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtg540caagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatg600tgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccgaaactggcaggcttgagtctcgtag660aggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtg720gcgaaggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaaca780ggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttg840aggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggt900taaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcga960tgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacagaactttccagagatggaaagg1020tgccttcgggaactgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatg1080ttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccggg1140aactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatca1200tggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgatct1260cgcgagagccagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcga1320ctccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttccc1380gggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagct1440taaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaag1500gtaacc1506

权利要求：1.一株油脂降解菌，其特征在于，该油脂降解菌为考氏科萨克氏菌Kosakoniacowanii，其中该油脂降解菌编号：IUMRB67，保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO.18023。2.如权利要求1所述的油脂降解菌的应用，其特征在于，所诉油脂降解菌，对被油脂污染的环境具有修复作用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所诉油脂降解菌，对被餐厨垃圾中废弃油脂污染的环境，具有修复作用。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所诉油脂降解菌，对被餐厨废水中的油脂污染的水体，具有修复作用。5.如权利要求1所述的油脂降解菌的应用，其特征在于，所诉油脂降解菌对餐厨垃圾中的废弃油脂具有降解作用。6.如权利要求1所述的油脂降解菌的应用，其特征在于，所诉油脂降解菌对餐厨废水中所含的油脂具有降解作用。7.如权利要求1所述的该油脂降解菌的筛选方法，其特征在于，步骤如下：1从餐馆垃圾桶中称取污泥，加入油脂降解菌筛选液体培养基进行富集，在35-40℃、150-200rmin恒温摇床中培养4-10天；2吸取步骤1中所得的培养物加入新的油脂降解菌筛选液体培养基进行传代，如此传代3-6次；3取步骤2中所得的培养物在LB平板上划线分离，得到油脂降解菌IUMRB67；其中油脂降解菌筛选培养基成分为：每1L去离子水中含有大豆油20mL,硫酸铵2g，磷酸二氢钾KH2PO40.5g，七水合硫酸镁MgSO4·7H2O0.2g，磷酸氢二钾K2HPO41.5g，氯化钠1g，pH7.0-7.2；LB固体培养基成分为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，pH7.0-7.2，以去离子水补足体积至1L。8.如权利要求7所述的该油脂降解菌的筛选方法，其特征在于，步骤如下：1从餐馆垃圾桶中称取污泥5克，加入100mL油脂降解菌筛选液体培养基进行富集，在37℃、180rmin恒温摇床中培养5-7天；2吸取步骤1中所得的培养物3mL加入新的油脂降解菌筛选液体培养基进行传代，如此传代4-5次；3取步骤2中所得的培养物在LB平板上划线分离，得到油脂降解菌IUMRB67。9.如权利要求1所述的该油脂降解菌IUMRB67的干粉剂，其特征在于，所述干粉剂为用使用扩大培养后的油脂降解菌IUMRB67培养物，经过常规方法干燥而成。

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