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申请/专利权人：中南大学

摘要：本发明公开了一种青年猪胰岛分离方法及分离用消化液。所述的消化液在使用以基础培养基或者平衡盐溶液为液相添加了常规消化酶的基础上添加了DNaseⅠ、中性蛋白酶、Ⅰ、Ⅲ型胶原酶、CaCl2、Trolox、生长抑素等。同时在做胰岛分离时改变传统灌注消化法，变为剪碎组织消化法，以提高青年猪胰岛得率。本发明在不影响猪胰岛细胞功能的情况下，能够稳定提高胰岛细胞得率、降低经济成本，并且易于操作，降低污染概率。

主权项：1.一种青年猪胰岛分离方法，其特征在于，采用剪碎组织的方式进行消化，消化液是在以基础培养基或者平衡盐溶液为液相添加了常规消化酶的基础上加入DNaseⅠ，中性蛋白酶，Ⅰ、Ⅲ型胶原酶，CaCl2，Trolox，生长抑素；所述的消化液中加入5~10UmlDNaseⅠ，4000-12000Ug中性蛋白酶，浓度均为0.1~0.5mgml的Ⅰ、Ⅲ型胶原酶，1~10mMCaCl2，1~10mMTrolox，1~5ugml生长抑素；所述的常规消化酶为Ⅴ型胶原酶，添加浓度为0.1~1mgml；所述的基础培养基为RPMI1640，所述的平衡盐溶液为HBSS；具体为以下步骤：1）将冷缺血时间＜30min的青年猪胰腺沁入碘酒，生理盐水后转移到无菌托盘中，托盘保持冰浴；2）去除胰腺的淋巴和结缔组织；3）将胰腺转入50ml无菌离心管中称重并记录；4）加10ml缓冲液，剪刀剪碎胰腺组织直径为3~5mm，取胰腺重量2~5g，加缓冲液至50ml、混匀，200g离心1min，弃上清30~35ml，重复一次；5）剪碎组织中加25~30ml消化液后继续剪至组织直径为1~5mm；6）将剪碎的组织转移至250ml锥形瓶中，加消化液至100ml；7）锥形瓶封口，37℃、100rpm震荡15~20min，消化液变浑时加中和液至250ml中止消化；所述的中和液为含有5%猪血清的HBSS缓冲液；8）将40目金属滤网置于烧杯上，过滤步骤7）制备的组织消化液，并用10ml注射器活塞在金属滤网上进行研磨，直至滤完所有消化液；9）中和液清洗2次，200rpm、2min离心，弃上清；10）冷HBSS重悬，200rpm、2min离心，弃上清，重复2次；11）加入预冷的成熟培养基重悬沉淀组织，200rpm、2min离心；所述的成熟培养基为含有10%猪血清的RPMI1640培养基；12）成熟培养基重悬组织细胞，平均分至培养瓶中，37oC、5%CO2培养，每只猪分4~6个T-175的悬浮培养瓶。

全文数据：一种青年猪胰岛分离方法及分离用消化液技术领域[0001]本发明属于猪胰岛细胞分离的技术领域，具体是涉及一种青年猪胰岛分离新方法及分离用消化液。背景技术[0002]型糖尿病是一种全球性的严重威胁人类健康的代谢性疾病，以选择性免疫介导性破坏胰岛辟田胞为特点，患者需要外源性胰岛素终身治疗。但是各种并发症导致患者生活、经济负担加重和死亡率的上升。自Edmonton方案成功后，胰岛移植受到了世界的瞩目，在总结了全球胰岛移植研究成果的基础上改进了移植的方法和免疫抑制方案，为I型糖尿病病人带来了治愈的希望。同种异体移植的人类胰腺胰岛已被证明是一种可行的选择治疗I型糖尿病的方法，移植后可改善控制患者血糖，减少胰岛素需求，降低低血糖症的发生。胰岛移植目前已经成为I型糖尿病患者的有效方法，但是人胰岛来源困难，胰岛分离技术还不完善，并且存在疾病传播的风险。最近，猪胰岛移植被证实是解决胰岛来源短缺的一个可行性方案。[0003]选择人类胰岛移植还是异种移植治疗I型糖尿病的因素有许多，包括安全性、临床疗效以及胰岛的获得率等。异种胰岛移植是近年来应用胰岛移植治疗胰岛素依赖型糖尿病的一个研究热点，同种移植和干细胞移植有其较多的局限性，而猪胰岛素和人胰岛素相差一个非保守区氨基酸序列，在人体能够发挥正常功能，且来源比较丰富，因而被认为是目前适宜的供体来源。青年猪胰腺虽未完全发育成熟，但与新生猪比较，其胰腺体积、重量等都较大，胰岛α-Gal抗原表达相对较弱，且胰岛成熟度相对较高，因此可获得大量成熟胰岛细胞。但是，青年猪的胰岛缺少完整的包膜环绕，分离和纯化过程较为复杂，胰岛结构和功能完整性极易在此过程中被破坏，从而影响胰岛得率和功能。如何高效、成功的分离猪胰岛细胞就成为猪胰岛移植的制约因素，传统分离方法存在胰岛得率、纯度低、可操作性弱或者经济成本高等问题，从而造成各方面资源的浪费。因此需进一步研究和改进青年猪胰岛分离纯化技术，以获得足量结构完整、功能良好的胰岛细胞.从而满足大动物移植实验和临床移植的需要。本研究方法旨在探讨和改良青年猪胰岛分离纯化技术。通过剪碎组织消化法以及特别配方的消化液联合使用，以优化青年猪胰岛制备方法，提高胰岛得率。发明内容[0004]本发明的目的是提供一种在不影响胰岛功能的情况下，能够稳定提高胰岛得率的青年猪胰岛分离方法以及用于分离的消化液，该方法易于操作，降低污染概率。[0005]—种青年猪胰岛分离方法，采用剪碎组织的方式进行消化，消化液是在以基础培养基或者平衡盐溶液为液相添加了常规消化酶的基础上加入DNaseI、中性蛋白酶、I、ΙΠ型胶原酶、CaCl2、Trolox、生长抑素。[0006]所述的消化液中加入5〜lOUmlDNaseI、12000-4000ug中性蛋白酶、浓度均为0·1〜0·5mgml的I、ΙΠ型胶原酶、1〜IOmMCaCl2、1〜IOmMTrolox、1〜5ugml生长抑素；所述的常规消化酶为V型胶原酶，添加浓度为0.1〜lmgml;所述的基础培养基为RPMI1640，所述的平衡盐溶液为HBSS。[0007]作为进一步的改进，所述的消化液中I、m型胶原酶的浓度均为0.5mgml,CaCl2SImM;Trolox为5mM，生长抑素为2.5ugml。[0008]作为进一步的改进，剪碎胰腺组织至组织直径为1〜5mm，加消化液处理。[0009]作为进一步的改进，消化液与胰腺组织的液固比20〜50mlg胰腺。[0010]作为进一步的改进，先粗略剪碎胰腺，用HBSS缓冲液处理，再继续剪碎后用消化液处理。[0011]作为进一步的改进，加IOml缓冲液，剪刀剪碎胰腺组织直径为3〜5mm，取胰腺重量2〜5g后，加缓冲液至50ml、混勾，200rpm离心Imin，弃上清30〜35ml，重复一次;剪碎组织中加25〜30ml消化液后继续剪至组织直径为1〜5mm;将剪碎的组织加消化液至100ml。[0012]作为进一步的改进，具体包括以下步骤：[0013]1准备好冷缺血时间30min的青年猪胰腺；[0014]2将胰腺先后沁入碘酒，生理盐水后转移到无菌托盘中，托盘保持冰浴；[0015]3去除胰腺的淋巴和结缔组织；[0016]4将胰腺转入50ml无菌离心管中称重并记录；[0017]5加IOml缓冲液，剪刀剪碎胰腺组织直径为3〜5mm，取胰腺重量2〜5g，加缓冲液至50ml、混勾，200g离心Imin，弃上清30〜35ml，重复一次；[0018]6剪碎组织中加25〜30ml消化液后继续剪至组织直径为1〜5mm;[0019]7将剪碎的组织转移至250ml锥形瓶中，加消化液至IOOml;[0020]8锥形瓶封口，37°C、100rpm震荡15〜20min，消化液变浑时加中和液至250ml中止消化;所述的中和液为含有5%猪血清的HBSS缓冲液；[0021]9将40目金属滤网置于烧杯上，过滤步骤8制备的组织消化液，并用IOml[0022]注射器活塞在金属滤网上进行研磨，直至滤完所有消化液；[0023]10中和液清洗2次，200rpm、2min离心，弃上清；[0024]11冷HBSS重悬，200rpm、2min离心，弃上清，重复2次；[0025]12加入预冷的成熟培养基重悬沉淀组织，200rpm、2min离心；所述的成熟培养基为含有10%猪血清的RPMI1640培养基。[0026]13成熟培养基重悬组织细胞，平均分至培养瓶中，37°C、5%⑶2培养，每只猪分4〜6个T-175的悬浮培养瓶。[0027]本发明的创新点如下：[0028]DNAse作用于胞外DNA，胞外DNA对多数种类的生物膜结构具有重要作用，对生物膜形成具有促进作用，可影响生物膜的起始黏附和生物膜的成熟。DNAse可分解已成熟的生物膜，降低生物膜的黏附性。对DNA的破坏导致胞内基质胞外聚合物的降低起到一定作用，防止消化后释放DNA导致溶液过粘。常规消化酶使细胞间质的脯氨酸多肽水解，从而使细胞离散。[0029]中性蛋白酶，能够水解组织蛋白，是一类在中性条件下作用于蛋白质肽键的蛋白酶，可将蛋白质水解成多肽或游离氨基酸，有助于细胞的离散，同时还可有效清除羟自由基，减弱蛋白水解过程中产生的氧化应激反应;I、m型胶原酶作用于胶原蛋白Gly-Xaa-Yaa-Gly-重复序列中的赖氨酸精氨酸和甘氨酸间的连接，从C端水解胶原物质，配合V型胶原酶从N端开始水解胶原的特性，可有效提高消化酶的利用率，加快细胞分离过程，提高分离效率;Ca2+可与胶原酶PKD与CBD区钙离子结合位点结合，起到稳定分子构象，提高胶原酶稳定性的目的，能够有效提高消化酶利用率;Trolox，可以预防过氧化亚硝酸盐导致的氧化胁迫，有抗细胞凋亡，减少氧化应激的作用，可有效防止消化过程中产生氧化自由基对分离的胰岛细胞产生伤害。加入生长抑素可有效抑制胰腺的外分泌功能，降低胰蛋白酶活性，防止外分泌腺对胰岛细胞产生损伤作用本发明结合各种酶的特点，联合使用抗氧化应激、抗凋亡、抑制外分泌腺药物等，在分离胰岛细胞的过程中联合使用，以达到提高胰岛得率，提高消化酶利用率，降低胰岛细胞分离经济成本的目的。[0030]除了本发明采用的新配方的消化液，同时配合采用剪碎组织的方式进行消化，可获得得率为1.67X104IEQg、纯度为75.3%的胰岛，相对于传统的分离胰岛方法有显著性的提高。胰岛功能检测结果显示，应用本发明分离的胰岛细胞其SI为2.27,胰岛细胞功能良好，与常规分离方法取得的胰岛细胞功能无显著性差异，且操作过程简单、易行。[0031]与现有技术比，本发明取得的优势：[0032]1、单位重量胰腺胰岛获得率显著性提高；[0033]2、成功避免了在普通消化下所产生的细胞成串现象及过度消化的情况，从而减少膜岛细胞损失；[0034]3、分离的胰岛大小适中，符合大动物移植实验和临床移植的需要；[0035]4、相比于常用的灌注消化法，易于操作；[0036]5、使用本发明可有效提高消化液的利用率，降低青年猪胰岛细胞分离经济成本。附图说明[0037]图1为不同浓度i、m型胶原酶配合V型胶原酶在不同消化时间下获得胰岛细胞的效率及质量100X;[0038]图1中结果证实，在浓度为0.5mgml下，分离效率优于其他分组，因此后续实验均采用浓度为〇.5mgmlI、m型胶原酶配合V型胶原酶消化胰腺。消化时间以17分钟最优。[0039]图2为Α0ΕΒ检测不同浓度I、ΙΠ型胶原酶配合V型胶原酶在相同消化时间下，细胞凋亡情况100X;[0040]图2中结果证实，相对于其他两组，浓度为0·lmgml和0·5mgml下，细胞活率较好，代表活细胞的绿色荧光较多，代表死细胞的红色荧光较少，但是〇.lmgml浓度下获得胰岛细胞所需消化时间较长，增加了热缺血的时间，不利于后期培养移植使用。[0041]图3为分离48h后DTZ染色胰岛细胞形态（100X;[0042]图3中，实验组为本发明方法分离得到的胰岛细胞，对照组为与本发明方法相比差别在于仅使用V型胶原酶作为消化液分离得到的胰岛细胞。[0043]图4为不同浓度Trolox与生长抑素配合使用下，胰岛细胞凋亡情况；[0044]图4结果显示:在加入Trolox与生长抑素的条件下，代表活细胞的绿色荧光较多，代表死细胞的红色荧光较少，细胞活率较好，从经济成本方面考虑，选择5mMTrolox配合2.5ugml生长抑素使用。[0045]图5为胰岛细胞得率；[0046]图5中，实验组为本发明方法分离得到的胰岛细胞，对照组1为与本发明方法相比差别在于仅使用V型胶原酶作为消化液分离得到的胰岛细胞，对照组2为采用传统灌注消化法配合V型胶原酶作为消化液的方法分离得到的胰岛细胞。[0047]图6为胰岛细胞大小比较um。[0048]图6中，实验组为本发明方法分离得到的胰岛细胞，对照组为与本发明方法相比差别在于仅使用V型胶原酶作为消化液分离得到的胰岛细胞。使用本发明获得的胰岛细胞在大小上更适合后期移植需要。具体实施方式[0049]以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。[0050]实施例1:青年猪胰岛的分离：[0051]1、准备好所要用到的离心管、锥形瓶、托盘等容器，并做好标记；[0052]2、分离青年猪胰腺冷缺血时间30min;[0053]3、将胰腺先后沁入碘酒，生理盐水后转移到无菌托盘中，托盘保持冰浴；[0054]4、去除胰腺多余的淋巴和结缔组织；[0055]5、将胰腺转入50ml无菌离心管中称重并记录；[0056]6、加IOml缓冲液，剪刀剪胰腺Imin后，加缓冲液至50ml、混匀，200g离心Imin，弃上清30〜35ml，重复一次；[0057]7、剪碎组织中加25〜30ml消化液后继续剪IOmin至组织直径为1〜5mm;[0058]8、将剪碎的组织转移至250ml锥形瓶中，加消化液至IOOml;[0059]9、锥形瓶封口，37°C、IOOrpm震荡15〜20min，消化液变浑时加中和液至250ml中止消化；[0060]10、将金属滤网置于烧杯上，4〜5ml次过滤，并用IOml注射器活塞在金属滤网上进行研磨，直至滤完所有消化液若滤网上胰腺组织较多应及时更换滤网）；[0061]11、中和液清洗滤网至总体积达到500ml250ml+250ml，200g、2min离心，弃上清；[0062]12、冷HBSS重悬并合并沉淀组织，200g、2min离心，弃上清，重复2次；[0063]13、加入预冷的成熟培养基重悬沉淀组织，200g、2min离心；[0064]14、成熟培养基重悬组织细胞，平均分至培养瓶中，37°C、5%⑶2培养每只猪大概可分4〜6个T-175的悬浮培养瓶）。[0065]实施例2:胰岛形态、数量检测[0066]材料与试剂：50ml离心管、250ml离心管、250ml锥形瓶、500um金属滤网、IOml注射器、金属托盘、水浴锅、培养箱、离心管架、剪刀、止血钳、培养瓶、烧杯、JPI完全培养基、猪血清、HBSS、抗生素、碘酒、DNA酶、生理盐水等[0067]Α0ΕΒ检测胰岛细胞凋亡:量取吖啶橙AO、溴乙锭EB各lmg，分别溶于IOmlpH7.2PBS中使之配成100ygml的母液，4°C避光保存、备用。用前等量混合。取细胞悬液ΙΟΟμΙ，加入Α0ΕΒ染料4μ1混匀，取一滴滴于载玻片，荧光显微镜下观察结果。结果见图1、2、4。[0068]DTZ染色观察胰岛细胞的形态、数目及纯度[0069]将IOmgDTZ溶于IOml的二甲基亚砜DMSO中，用0.22μπι的孔径滤膜过滤除菌后分装储存于-20°C冰箱内。常规染色时，每Iml胰岛细胞悬液与10μ1的DTZ储存液混合，于37°C孵育10分钟后镜检，胰岛细胞被染成猩红色后观察细胞的形态，结果见图3。[0070]胰岛纯度=DTZ染色阳性的胰岛细胞团数细胞团总数X100%。本发明获得得率为1.67X104IEQg、纯度为75.3%的胰岛，相对于传统的分离胰岛方法（即对照组2有显著性的提高，结果见图3。[0071]实施例3:胰岛功能检测[0072]1、胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能[0073]胰岛细胞分别培养至第6天及第10天时，分别提取6000IEQ的细胞悬液自然沉淀6分钟后吸出细胞，用含2.5mM低糖培养液洗涤两次并孵化细胞于37°C、5%CO2培养箱1小时，取出细胞悬液让其自然沉淀6分钟，每组胰岛细胞平均分成2份，每份再分成3个平行孔，分别加入2ml含2.5mM低糖培养液Hyclone培养基及2ml含25mM高糖培养液Hyclone培养基）于6孔培养皿内，放入37°C、5%CO2培养箱内再培养2小时后，离心取上清液，通过化学发光法来检测胰岛素含量。计算葡萄糖刺激指数SIjIM.8代表胰岛细胞的功能良好。[0074]葡萄糖刺激指数Stimulationindex，SI=25mM葡萄糖培养时的胰岛素释放量2.5mM葡萄糖培养时的胰岛素释放量[0075]表1各组胰岛细胞葡萄糖刺激指数[0077]实验组为本发明方法制备得到的胰岛细胞，对照组为与本发明方法相比差别在于仅使用V型胶原酶作为消化液分离得到的胰岛细胞，结果说明两组试验结果相差不大，进一步说明本发明方法不影响猪胰岛细胞功能。[0078]2、InsulinDNA检测胰岛素含量[0079]提取1200IEQ胰岛细胞，每组细胞用600μ1PBS悬浮后平均分成2份，每份再分成2个平行孔分别转移至2ml的离心管内，其中1份每孔分别加入ImlAzol用于胰岛素检测，另夕卜1份未加Azol的细胞悬液用于DNA检测。[0080]2.1试剂的配置[0081]DAzol的配置[0082]将RIA-BSAl.25g及乙酸57ml溶于500ml的蒸馏水内混匀后配成溶液，放于4°C冰箱内保存备用。[0083]2FSA的配置[0084]将NaCl4.383g、NaH2P〇4·H2O0.780g、NaH2P〇4·2H200.881g及RIA-BSA0.25g溶于500ml的蒸馏水内混匀，配成溶液，将溶液的pH值调至7.35后，放于4°C冰箱内保存备用。[0085]2.2胰岛素检测[0086]把上述加入ImlAzol的两孔细胞悬液置于冰上，用超声破碎仪破碎20秒后，取50μ1上清于2ml的离心管内放于烤箱内烘干，烘干后加入500μ1FSA，放于-20°c冰箱内保存，最后统一通过化学发光法来检测胰岛素含量。[0087]2·3DNA检测[0088]把上述未加Azol的两孔细胞悬液统一按照AxyPrep基因组DNA小量试剂盒的操作说明来提取DNA，具体操作步骤如下：[0089]1加入250μ1的去离子水或PBS悬浮细胞。[0090]2加入0·8μ1的RNaseΑ，震荡15s后室温下静置lmin。[0091]3加入150μ1的bufferC-L和8μ1的proteinaseK，震荡Imin使其混合均勾，经过离心然后把离心管放于56°C水浴lOmin。[0092]4加入350μ1的bufferP-D，为使其混合均匀利用漩涡震荡30s，12，000Xg离心IOmin0[0093]5将DNA制备管放于2ml离心管之中，将上一步骤中的混合液移入制备管之中，12，000Xg离心Imin0[0094]6弃掉滤液，把制备管置于原来的2ml的离心管之中，然后加入500μ1的BufferWl12，000Xg离心lmin。[0095]7弃掉滤液，把制备管置于原来的2ml的离心管之中，然后加入700μ1的BufferW212，000Xg离心Imin，用相同的方法，加入700μ1的BufferW2再洗涤一次。[0096]8弃掉滤液，把制备管置于原来的2ml的离心管之中，12，000Xg离心lmin。[0097]9将DNA制备管放于另一洁净的1.5ml的离心管之中，于制备管膜的中央加入100-200μ1的Eluent或去离子水，室温下静置Imin后，12，000Xg离心Imin洗脱DNA。[0098]10DNase-free水稀释10XDNA样品，DNA样本的质量和浓度利用核酸蛋白分析仪来检测。[0099]表2各组胰岛细胞的InsulinDNA值的比较[0101]实验组为本发明方法制备得到的胰岛细胞，对照组为与本发明方法相比差别在于仅使用V型胶原酶作为消化液分离得到的胰岛细胞，结果说明两组试验结果相差不大，进一步说明本发明方法不影响猪胰岛细胞功能。

权利要求：1.一种青年猪胰岛分离方法，其特征在于，采用剪碎组织的方式进行消化，消化液是在以基础培养基或者平衡盐溶液为液相添加了常规消化酶的基础上加入DNaseI、中性蛋白酶、Ι、ΙΠ型胶原酶、CaCl2、Trolox、生长抑素。2.根据权利要求1所述的青年猪胰岛分离方法，其特征在于，所述的消化液中加入5〜10UmlDNaseI、12000-4000ug中性蛋白酶、浓度均为O·1〜O·5mgml的I、ΙΠ型胶原酶、1〜IOmMCaC12、1〜IOmMTrolox、1〜5ugml生长抑素;所述的常规消化酶为V型胶原酶，添加浓度为〇.1〜lmgml;所述的基础培养基为RPMI1640，所述的平衡盐溶液为HBSS。3.根据权利要求1所述的青年猪胰岛分离方法，其特征在于，所述的消化液中i、m型胶原酶的浓度均为0.5mgml，CaCh为ImM;Trolox为5mM，生长抑素为2.5ugml。4.根据权利要求1所述的青年猪胰岛分离方法，其特征在于，剪碎胰腺组织至组织直径为1〜5mm，加消化液处理。5.根据权利要求1所述的青年猪胰岛分离方法，其特征在于，消化液与胰腺组织的液固比20〜50mlg胰腺。6.根据权利要求1所述的青年猪胰岛分离方法，其特征在于，先粗略剪碎胰腺，用HBSS缓冲液处理，再继续剪碎后用消化液处理。7.根据权利要求1所述的青年猪胰岛分离方法，其特征在于，加IOml缓冲液，剪刀剪碎胰腺组织直径为3〜5mm，取胰腺重量2〜5g后，加缓冲液至50ml、混匀，200rpm离心Imin，弃上清30〜35ml，重复一次;剪碎组织中加25〜30ml消化液后继续剪至组织直径为1〜5mm;将剪碎的组织加消化液至IOOml。8.根据权利要求1所述的青年猪胰岛分离方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1准备好冷缺血时间30min的青年猪胰腺；2将胰腺先后沁入碘酒，生理盐水后转移到无菌托盘中，托盘保持冰浴；3去除胰腺的淋巴和结缔组织；4将胰腺转入50ml无菌离心管中称重并记录；5加IOml缓冲液，剪刀剪碎胰腺组织直径为3〜5mm，取胰腺重量2〜5g，加缓冲液至50ml、混勾，200g离心Imin，弃上清30〜35ml，重复一次；6剪碎组织中加25〜30ml消化液后继续剪至组织直径为1〜5_;7将剪碎的组织转移至250ml锥形瓶中，加消化液至IOOml;8锥形瓶封口，37°C、IOOrpm震荡15〜20min，消化液变浑时加中和液至250ml中止消化；所述的中和液为含有5%猪血清的HBSS缓冲液；9将40目金属滤网置于烧杯上，过滤步骤8制备的组织消化液，并用IOml注射器活塞在金属滤网上进行研磨，直至滤完所有消化液；10中和液清洗2次，200rpm、2min离心，弃上清；11冷HBSS重悬，200rpm、2min离心，弃上清，重复2次；12加入预冷的成熟培养基重悬沉淀组织，200rpm、2min离心;所述的成熟培养基为含有10%猪血清的RPMI1640培养基。13成熟培养基重悬组织细胞，平均分至培养瓶中，37°C、5%⑶2培养，每只猪分4〜6个T-175的悬浮培养瓶。9.一种青年猪胰岛分离用消化液，其特征在于，消化液是在以基础培养基或者平衡盐溶液为液相添加了常规消化酶的基础上加入DNaseI、中性蛋白酶、I、ΙΠ型胶原酶、CaCl2、Trolox、生长抑素。10.根据权利要求9所述的青年猪胰岛分离用消化液，其特征在于，所述的消化液中加入5〜10UmlDNaseI、12000-4000ug中性蛋白酶、浓度均为0·1〜0·5mgml的I、ΙΠ型胶原酶、1〜IOmMCaCl2、1〜IOmMTrolox、1〜5ugml生长抑素;所述的常规消化酶为V型胶原酶，添加浓度为0.1〜lmgml;所述的基础培养基为RPMI1640，所述的平衡盐溶液为HBSS。

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