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申请/专利权人：四川农业大学

摘要：本发明公开了一种矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用，该InDel分子标记的上游引物核苷酸序列如SEDIDNO.1所示、下游引物核苷酸序列如SEDIDNO.2所示，以所述分子标记的引物对波兰小麦基因组DNA进行PCR扩增，当扩增产物只含有大小为111bp的片段时，小麦为矮秆波兰小麦；当扩增产物含有大小为103bp的片段时，小麦为高秆波兰小麦；当扩增产物为杂合带型时，小麦为高秆波兰小麦；矮秆波兰小麦的扩增产物中含有核苷酸序列‑ATGCACTG‑。本发明的InDel标记能够在苗期就快速区分波兰小麦的植株高矮，为小麦株高改良的育种工作提供了指导。

主权项：1.一种与矮秆波兰小麦株高相关的Rht-dp基因的InDel分子标记，其特征在于，该InDel分子标记的上游引物核苷酸序列如SEDIDNO.1所示、下游引物核苷酸序列如SEDIDNO.2所示，以所述分子标记的引物对波兰小麦基因组DNA进行PCR扩增，当扩增产物只含有大小为111bp的片段时，小麦为矮秆波兰小麦；当扩增产物含有大小为103bp的片段时，小麦为高秆波兰小麦；当扩增产物为杂合带型时，小麦为高秆波兰小麦；矮秆波兰小麦的扩增产物中含有核苷酸序列-ATGCACTG-。

全文数据：一种矮秆波兰小麦的InDeI标记及鉴定方法和应用技术领域[0001]本发明属于DNA分子标记技术领域，涉及InDel标记技术，具体涉及一种矮杆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用。背景技术[0002]株高是影响植物倒伏、收获指数以及产量的重要农艺性状。在小麦中，至今发现25个矮化基因（30个等位位点），其中9个来源于四倍体小麦。来源于我国新疆吐鲁番的矮杆波兰小麦（DwarfPolishWheat，2n=4x=28，AABB，TriticumpolonicumL.携带一个隐性矮化基因Rht-dp。该基因位于4BS染色体，与4BS上已有的矮化基因Rht-Bl非等位，前人将该基因初定位在4BS染色体上，但其遗传距离较大，不利于该基因的图位克隆。[0003]小麦植株高矮是决定小麦产量的重要因素之一，在小麦的育种过程中，不断发现和利用矮杆基因使得世界小麦产量得到了进一步增加。因此，矮杆基因的不断探索、挖掘、鉴定、研究和利用，对小麦高产育种意义重大。发明内容[0004]本发明的目的是提供一种矮杆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用，该标记能够在苗期就快速区分波兰小麦的植株高矮，为小麦株高改良的育种工作提供了指导。[0005]为了达到上述目的，本发明提供了一种矮杆波兰小麦的InDel标记，该InDel标记是对矮杆波兰小麦基因组核苷酸序列中第109位到第116位核苷酸之间的核苷酸序列-ATGCACTG-进行标记。[0006]本发明还提供了一种矮杆波兰小麦InDel标记的核苷酸序列，该核苷酸序列处于矮杆波兰小麦基因组核苷酸序列中第109位到第116位核苷酸之间，其包含：序列-ATGCACTG-o[0007]本发明还提供了核苷酸序列在鉴定波兰小麦株高的应用，所述的核苷酸序列包含:序列-ATGCACTG-，通过InDel标记该核苷酸序列以鉴定波兰小麦的株高。[0008]优选地，在所述的InDel标记中，PCR扩增采用的上游引物包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列，采用的下游引物包含如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列。[0009]本发明还提供了一种InDel标记的上下游引物，上游引物包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列，下游引物包含如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列。[0010]本发明还提供了一种InDel标记核苷酸序列鉴定波兰小麦株高的方法，该方法包含：[0011]⑴提取波兰小麦DNA;[0012]2PCR扩增:采用的上游引物包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列，采用的下游引物包含如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列；[0013]⑶扩增DNA片段检测分析：当扩增产物含有大小为IlObp的片段时，小麦为矮杆波兰小麦；当扩增产物含有大小为l〇2bp的片段时，小麦为高杆波兰小麦；当扩增产物为杂合带型时，小麦为高杆波兰小麦。[0014]其中，所述的矮杆波兰小麦基因中含有核苷酸序列-ATGCACTG-。[0015]优选地，在步骤⑴中，采用CTAB法提取基因组DNA。[0016]优选地，在所述的步骤3中，采用扩增DNA片段检测分析变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染进行检测分析。[0017]本发明还提供了一种鉴定波兰小麦株高的试剂盒，该试剂盒包含:具有如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列的上游引物，和具有如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列的下游引物。[0018]本发明的矮杆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用，具有以下优点：[0019]1本发明的通过InDel标记小麦核苷酸序列-ATGCACTG-，鉴定标记的扩增条带特性，判断出植株的表型是高杆和矮杆，通过田间统计的株高数据，对于高矮杆植株株高的临界值106cm进行划分，用于指导小麦株高改良的育种工作；[0020]2本发明的分子标记不仅在苗期就能区分植株高矮杆，而且对于目标基因的定位有很大的帮助，极大的降低了劳动成本、节约了时间并且不受环境及人为因素的影响。附图说明[0021]图1为本发明实验例3InDel标记在矮杆波兰小麦X高杆波兰小麦F7代重组自交系中的分型结果。[0022]图2为本发明实验例3InDel标记在矮杆波兰小麦X高杆波兰小麦F2代重组自交系中的分型结果。具体实施方式[0023]以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。[0024]一种矮杆波兰小麦的InDel标记，该InDel标记是对矮杆波兰小麦基因组核苷酸序列中第109位到第116位核苷酸之间的核苷酸序列-ATGCACTG-进行标记。核苷酸序列-ATGCACTG-名称:4BS-PMT2作为InDel标记基，用于鉴定波兰小麦株高，当扩增产物含有SEDIDNO.1时，该矮杆波兰小麦；当扩增产物不含SEDIDNO.1时，小麦为高杆波兰小麦。具体地，当扩增产物的大小为IlObp时，小麦为矮杆波兰小麦；当扩增产物的大小为102bp时，小麦为高杆波兰小麦;当扩增产物为杂合带型时，小麦为高杆波兰小麦。[0025]进一步地，在InDel标记中，PCR扩增采用的上游引物包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列，采用的下游引物包含如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列。[0026]—种鉴定波兰小麦株高的试剂盒，该试剂盒包含:具有如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列的上游引物，和具有如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列的下游引物，以对波兰小麦株尚进彳丁鉴定。[0027]本发明的InDel标记核苷酸序列鉴定波兰小麦株高的方法，具体如下：[0028]实验例1基因组DNA提取[0029]在幼苗期时，对矮杆波兰小麦X高杆波兰小麦重组自交系FdPF7代群体各单株挂牌标明株号并取其嫩叶，F2代编号1-26，F7代编号1-26，放入液氮中迅速冷冻，再放入-70°C超低温冰箱备用。[0030]对上述自交系群体FdPF7代分别提取总基因DNA，具体操作参照Doyle等（1987的2XCTAB法（CTAB,hexadecyItrimethylammoniumbromide，十六烧基三甲基溴化铵），2XCTAB提取液的组成（IOOOmL如下表I:[0031]表I2XCTAB提取液的组成表[0033]注：EDTA为EthyleneDiamineTetraaceticAcid，即乙二胺四乙酸；Tris-HCl为三轻甲基氨基甲烷。[0034]基因组DNA提取的步骤，具体如下：[0035]1取1〜2g幼嫩小麦叶片加液氮并迅速研磨成细粉，置入2mL离心管中加入预热至65°C的等体积2XCTAB缓冲液，加入β-疏基乙醇lyL，轻摇混匀；[0036]265°C水浴1〜2h，其间10〜15min轻摇混匀一次；[0037]3冷却至室温后，加等体积的氯仿-异戊醇体积比为24:1，轻轻上下颠倒混匀至上清液呈牛奶状，12000rpmmin离心IOmin;[0038]⑷取上清液，加入等体积冰冷的异丙醇以沉淀可提前放置于冰箱或制冰机中），挑出DNA;[0039]5用70%酒精洗，无水乙醇洗，空气中干燥；[0040]6按照上表1中的Tris-HCl和EDTA的量配制IXTEpH8.0缓冲液，将步骤⑸干燥的DNA溶于适量的IXTEpH8.0缓冲液以备用；[0041]⑺用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测或用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度。[0042]实验例2SSRSimplesequencerepeat，简单序列重复）反应[0043]PCR反应的组分和用量，具体如下表2:[0044]表2PCR反应的组分和用量表[0046]注：2XTaqMasterMixforPAGE购自Vazyme公司。[0047]上下游引物，具体如下表3:[0048]表3上下游引物序列表[0049][0050]PCR反应程序，具体如下表4:[0052]实验例3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染[0053]⑴药品配制[0054]8%聚丙稀酰胺卩八：尿素420.428、八：1'3^713111116，丙稀酰胺）8〇8、1^8bisacrylamide，双丙稀酰胺4.212g、10*TBETris硼酸）100mL。[0055]10XTBE2L:Tris-base216g，硼酸110g，EDTA-Na214.88g，加超纯水定容至1L。[0056]Binding亲和娃烧）：无水乙醇2mL，Binding原液8yL，冰醋酸8yL。[0057]Repel剥离娃烧）：三氯甲烧100mL，Repel2mL。[0058]银染液:蒸馏水1500mL，无水乙醇150mL，硝酸银溶液（lgmL1500uL。[0059]显影液：蒸馏水1500mL，氢氧化钠30g，甲醛6mL，硫代硫酸（10mgmL300yL。[0060]⑵洗板和擦板[0061]电泳槽板先用无水乙醇擦一遍，5min后用配制的剥离娃烧repel，4度保存，使电泳槽与胶分离溶液涂抹均匀，放置15〜30min。[0062]将玻板先用抹布蘸少许洗洁精在自来水下洗净，再用无水乙醇擦一遍，5分钟后用新鲜配制的溶液涂抹均匀，放置15〜30min;如为用过的玻板，则先用NaOH溶液（1瓶加约25L水，可反复使用浸泡1-2天，直至废胶脱落，再进行上述清洗。[0063]⑶装板[0064]玻板在下，电泳槽板在上，中间放两根压条涂抹repel和binding的面相互靠近），对齐后用三对夹子将波板与电泳槽板夹紧。[0065]⑷灌胶[0066]用针筒吸取凝胶混合液，缓慢均匀的从灌胶口将胶灌入，灌好后取下靠近灌胶口的夹子，倒插入梳子，注意不要起汽泡，插好后，再夹上夹子;凝胶需要1〜230min个小时；[0067]5预电泳主要是使凝胶的温度达到一定高度）[0068]取下夹子，拔出倒插的梳子，在自来水下将灌胶口冲洗干净，放入电泳槽，卡紧，灌入缓冲液，上下槽各300mL左右，上下槽用一样的缓冲液（S卩IXTBE注意用夹子夹紧上槽排放缓冲液的胶管;80W衡功率电泳半小时。[0069]⑹点样[0070]用吸管吹干净灌胶口的废胶，将梳子顺插入灌胶口，再用吸管将每个梳孔吹干净，开始点样，注意不要串样，梳齿不要将胶面弄坏。[0071]⑺电泳[0072]80W衡功率电泳Ih左右（电压可能达到1100V-2000V，若太高则有可能配错，将功率调低，以免温度过高，玻璃板裂开）。[0073]⑻银染[0074]将板子置于银染液15min。[0075]⑼水洗[0076]用蒸馏水洗3到4s主要是冲去银离子，免得遇光变黑，需5〜8s。[0077]10显影[0078]将板子置于显影液中10〜15min，直至条带清晰。[0079]11水洗[0080]自来水冲水洗银染板，将NaOH洗掉若不冲去NaOH，它会使凝胶氧化变黑）。[0081]结果统计：[0082]如图1所示，为本发明实验例3InDel标记在矮杆波兰小麦X高杆波兰小麦F7代重组自交系中的分型结果，如图2所示，为本发明实验例3InDel标记在矮杆波兰小麦X高杆波兰小麦F2代重组自交系中的分型结果，其中，Marker为pUC19DNAMspIHpaIIMarker购自thermo-金蓉诚，品牌型号ThermoFermentas-金蓉诚SM0222。标记4BS-PMT2,扩增产物中能扩增出l〇2bp片段，说明该植株为高杆波兰小麦，如果能扩增出IlObp片段，说明该植株为矮杆波兰小麦，如果扩增出杂合带型，说明该植株为高杆波兰小麦，进行统计对FdPF7分型和实际生长情况进行统计，如下表5所示，为本发明的F2代编号1-26的株高统计表，如下表6所示，为本发明的F7代编号1-26的株高统计表，将检测结果和株高进行对应，发现一致，表明本发明的方法的鉴别率为100%。[0083]表5本发明的?2代编号1-26的株高统计表[0086]表6本发明的F7代编号1-26的株高统计表[0088]~综上所述，本发明的矮杆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用，该InDel标记不仅在苗期就能区分植株高矮杆，而且对于目标基因的定位有很大的帮助，极大的降低了劳动成本、节约了时间并且不受环境及人为因素的影响。[0089]尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

权利要求：1.一种矮杆波兰小麦的InDel标记，其特征在于，该InDel标记是对矮杆波兰小麦基因组核苷酸序列中第109位到第116位核苷酸之间的核苷酸序列-ATGCACTG-进行标记。2.—种矮杆波兰小麦InDel标记的核苷酸序列，其特征在于，该核苷酸序列处于矮杆波兰小麦基因组核苷酸序列中第109位到第116位核苷酸之间，其包含:序列-ATGCACTG-。3.核苷酸序列在鉴定波兰小麦株高的应用，其特征在于，所述的核苷酸序列包含：序列-ATGCACTG-，通过InDel标记该核苷酸序列以鉴定波兰小麦的株高。4.根据权利要求3所述的小麦核苷酸序列在鉴定波兰小麦株高的应用，其特征在于，在所述的InDe1标记中，PCR扩增采用的上游引物包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列，采用的下游引物包含如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列。5.—种InDel标记的上下游引物，其特征在于，上游引物包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列，下游引物包含如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列。6.—种InDel标记核苷酸序列鉴定波兰小麦株高的方法，其特征在于，该方法包含：1提取波兰小麦DNA;2PCR扩增:采用的上游引物包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列，采用的下游引物包含如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列；⑶扩增DNA片段检测分析：当扩增产物含有大小为IlObp的片段时，小麦为矮杆波兰小麦；当扩增产物含有大小为l〇2bp的片段时，小麦为高杆波兰小麦；当扩增产物为杂合带型时，小麦为高杆波兰小麦；所述的矮杆波兰小麦基因中含有核苷酸序列-ATGCACTG-。7.根据权利要求6所述的InDel标记波兰小麦核苷酸序列的方法，其特征在于，在步骤⑴中，采用CTAB法提取基因组DNA。8.根据权利要求7所述的InDel标记波兰小麦核苷酸序列的方法，其特征在于，在所述的步骤⑶中，采用扩增DNA片段检测分析变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染进行检测分析。9.一种鉴定波兰小麦株高的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含:具有如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列的上游引物，和具有如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列的下游引物。

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