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申请/专利权人：桂林医学院

摘要：本发明公开了一种VIPR1基因在制备肝癌诊断产品和预后预测产品中的应用，属于生物医药技术领域。本发明公开了一种VIPR1基因在制备肝癌诊断产品中的应用，还公开了VIPR1基因在制备肝癌预后预测产品中的应用以及在制备治疗肝癌药物中的应用。本发明首次发现了VIPR1在实体瘤肝组织的异常表达，发现VIPR1基因可作为肝癌诊断和肝癌预后预测的特异标志基因，相比传统的检测手段，更快速、更特异、更灵敏、更准确，能够实现肝癌的早期诊断和预后预测，从而降低肝癌的死亡率，且为防治肝癌提供了新的治疗靶点和有效新药。

主权项：1.一种VIPR1基因在制备肝癌诊断产品中的应用，所述肝癌诊断产品包括：通过荧光定量PCR或免疫检测诊断肝癌的产品，所述通过荧光定量PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增VIPR1基因的引物，所述通过免疫检测诊断肝癌的产品包括与VIPR1蛋白特异结合的抗体。

全文数据：VIPR1基因在制备肝癌诊断产品和预后预测产品中的应用技术领域[0001]本发明涉及VIPRl基因在制备肝癌诊断产品和预后预测产品中的应用，属于生物医药技术领域。背景技术[0002]肝癌是全球范围和较不发达国家男性癌症死亡的第二大原因。肝癌发生率在东亚和东南亚以及北非和西非最高，在中南亚和北欧，中欧和东欧最低，约有50%的新发和死亡病例都在中国。由于肝癌的早期症状不明显，在发现时病人往往处于中晚期，失去手术机会，加之肝癌是高侵袭性癌，肿瘤侵袭、肝内扩散和肝外转移是导致患者死亡的主要原因。尽管诊断和治疗技术不断发展，肝癌的预后仍然很差，存在肿瘤转移和复发的风险。肝癌的转移复发是多基因、因子和信号通路共同协调，涉及许多调控因素的复杂过程。[0003]甲胎蛋白（AFP是原发性肝癌的血清学指标物，然而，临床发现肝癌患者中甲胎蛋白假阳性和假阴性率偏高，凭单一的甲胎蛋白血清学检测早期肝癌的漏诊率在50%以上，且有多篇报道指出肝癌组织中甲胎蛋白阳性患者与阴性患者之间的生存期差异无统计学意义。[0004]目前，国内筛选肝癌的相关基因主要采用的是以基因芯片为代表的高通量分子生物学技术，实验研究产生了海量的数据，已筛选鉴别出大量差异表达基因。但是很多和预后有关的指标在不同的研究中得到的结果不尽相同，产生偏倚的可能原因是大部分此类研究仅针对基因芯片的分析，以及样本数目、来源存在差异，导致得到的结果存在很多不一致性。[0005]血管活性肠肽受体IvasoactiveintestinalpeptidereceptorI，VIPR1编码血管活性肠肽vasoactiveintestinalpeptide，VIP的受体。VIPR是一类G蛋白偶联受体，分为两个亚型：VIPRl和VIPR2。广泛分布在整个中枢神经系统和外周组织包括肝、肺、肠、骨骼肌、心脏和肾脏。VIPRl和VIPR2的生物作用包括促进神经元存活、调节糖原代谢、刺激垂体释放催乳素和肾上腺髓质释放儿茶酚胺，以及免疫调节等。而VIPRl与肝癌发生和预后的相关性，目前尚未见报道。发明内容[0006]本发明的目的之一，是提供一种VIPRl基因在制备肝癌诊断产品中的应用。本发明的申请人通过对已发表的肝癌基因芯片数据和RNA测序数据进行分析、荧光定量PCR及免疫组化验证，发现VIPRl基因在肝癌组织中的表达与在正常组织中的表达存在差异。与正常组织相比，VIPRl基因在肝癌组织中的表达下调。本发明通过生物信息学手段挖掘出VIPRl基因在肝癌中的作用，从而对肝癌的发病机理进行探究，为其诊断和治疗提供研究基础。本发明首次发现了VIPRl在实体瘤肝组织的异常表达，发现VIPRl基因可作为肝癌诊断的特异标志基因，相比传统的检测手段，更快速、更特异、更灵敏、更准确，能够实现肝癌的早期诊断和预后判断，从而降低肝癌的死亡率。[0007]本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种VIPRl基因在制备肝癌诊断产品中的应用。[0008]在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。[0009]进一步，所述肝癌诊断产品包括:通过焚光定量PCR或免疫检测诊断肝癌的产品。[0010]更进一步，所述通过荧光定量PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增VIPRl基因的引物。[0011]更进一步，所述特异扩增VIPR1基因的引物为：上游引物F:5’-CCTCCATTCAAGGCCGCAAT-3’，下游引物R:5’-GCTGCTCATCCAAACTCGCT-3’。[0012]更进一步，所述通过免疫检测诊断肝癌的产品包括：与VIPRl蛋白特异结合的抗体。[0013]本发明的目的之二，是提供一种VIPRl基因在制备肝癌预测产品中的应用。本发明首次发现了VIPRl在实体瘤肝组织的异常表达，发现VIPRl基因可作为肝癌预后预测的特异标志基因，使肝癌预后预测更加准确、快速。[0014]本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种VIPRl基因在制备肝癌预后预测产品中的应用。[0015]在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。[0016]进一步，所述肝癌中VIPRl基因显著低表达，在癌旁和远隔的正常肝细胞中VIPRl基因有较高表达，肝癌组织中VIPRl表达越低者，预后越差。[0017]采用上述进一步的有益效果是:肝癌预后预测更准确快速。[0018]本发明的目的之三，是提供一种VIPRl基因在制备治疗肝癌药物中的应用。本发明首次发现了VIPRl在实体瘤肝组织的异常表达，为防治肝癌提供了新的治疗靶点和有效新药。[0019]本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种VIPRl基因在制备治疗肝癌药物中的应用。[0020]在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。[0021]进一步，所述肝癌中VIPRl基因显著低表达，在癌旁和远隔的正常肝细胞中VIPRl基因有较高表达。[0022]本发明的有益效果是：[0023]1.本发明首次发现了VIPRl在实体瘤肝组织的异常表达，发现VIPRl基因可作为肝癌诊断的特异标志基因，相比传统的检测手段，更快速、更特异、更灵敏、更准确，能够实现肝癌的早期诊断，从而降低肝癌的死亡率。[0024]2.本发明首次发现了VIPRl在实体瘤肝组织的异常表达，发现VIPRl基因可作为肝癌预后预测的特异标志基因，使肝癌预后预测更加准确、快速。[0025]3.本发明首次发现了VIPRl在实体瘤肝组织的异常表达，为防治肝癌提供了新的治疗靶点和有效新药。附图说明[0026]图1为Oncomine数据库中RoesslerLiver2基因芯片数据中VIPRl在肝癌组织和正常肝组织中的mRNA表达情况。[0027]图2为Oncomine数据库中RoesslerLiver基因芯片数据中VIPRl在肝癌组织和正常肝组织中的mRNA表达情况。[0028]图3为Oncomine数据库中WurmbachLiver基因芯片数据中VIPRl在肝癌组织和正常肝组织中的mRNA表达情况。[0029]图4为Oncomine数据库中MasLiver基因芯片数据中VIPRl在肝癌组织和正常肝组织中的mRNA表达情况。[0030]图5为Oncomine数据库中ChenLiver基因芯片数据中VIPRl在肝癌组织和正常肝组织中的mRNA表达情况。[0031]图6为TCGA数据库中VIPRl在肝癌组织和正常组织中的mRNA表达情况。[0032]图7为荧光定量PCR测定VIPRl在肝癌组织和配对癌旁组织中的mRNA相对表达量。[0033]图8为肝癌组织HE染色。[0034]图9为配对癌旁组织HE染色。[0035]图10为免疫组化检测VIPRl在肝癌组织中表达。[0036]图11为免疫组化检测VIPRl在配对癌旁组织中表达。[0037]图12为VIPRl在肝癌组织和配对癌旁组织中的免疫组化染色评分。[0038]图13为肝癌组织中VIPRl表达较低者与较高者的总生存率比较。具体实施方式[0039]以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。[0040]实施例IVIPRl在Oncomine和TCGA数据库中表达情况[0041]利用Oncomine数据库中的5个基因芯片数据以及TCGATheCancerGenomeAtlas中数据库的RNA测序数据，共包括1199例样本进行分析，以期获得更准确的结果，避免单纯基因芯片或RNA测序研究，以及小样本量研究带来的不正确性，降低假阳性。[0042]I.IOncomine数据库检索[0043]在Oncomine数据库（https:www·oncomine·orgresourcelogin·htmL中选择RoesslerLiver2、RoesslerLiver、WurmbachLiver、MasLiver和ChenLiver共5套基因芯片数据，输入“VIPR1”查看其在正常和肝癌组织中的表达差异。结果如图I-图5所示，与正常组织相比，VIPRl基因在肝癌组织的表达下调。[0044]1.2TCGA数据库检索[0045]从TCGA下载肝癌RNA测序数据，分析VIPRl基因的表达情况。结果如图6所示，与正常组织相比，VIPRl基因在肝癌组织中的表达下调。[0046]基因表达芯片数据和RNA测序数据分析均显示VIPRl基因在肝癌组织中异常表达，与正常组织相比的表达显著下调，表明VIPRl基因可能在维持肝组织的正常功能中起到重要作用，其表达下降可能与肝癌的发生和发展相关。[0047]实施例2荧光定量PCR验证VIPRl与肝癌的关系[0048]2.1组织来源[0049]30例肝癌及其癌旁组织来自桂林医学院附属医院肝胆外科收集自2015年1月_2015年9月手术切除标本。[0050]2.2荧光定量PCR检测[0051]2·2·1肝癌组织总RNA提取[0052]取冻存与液氮中的肝癌组织，放入预冷研钵中研磨，待组织样本成粉末后加入ImLTrizol，室温静置5min，将裂解物移入1.5mL离心管，加入氯仿0.2mL，用力振荡离心管，室温放置1〇111；[11。12000印1]1离心151]1；[11后取上层水相到另一新的离心管中。加入等体积的预冷异丙醇，颠倒混勾，冰上10111；[11。12000印1]1离心15111；[11后弃上清，加入75%乙醇11111^，振荡1111；[11，12000rpm离心5min，弃乙醇，室温静置5min，待乙醇挥发后，加入30yL的DEPC双蒸水，溶解RNA后，测0D260值，-80°C保存。[0053]2.2.2逆转录反应[0054]5XgDNAEraserBuffer2yL，gDNAEraserlyL，TotalRNA500ng，无RNA酶水加至总体积IOyL，42°C2min去除基因组DNA。5XPrimerScriptBuffer2加4yL，PrimerScriptRTEnzymeMixI加lyL，RTPrimerMix加lyL，之前的反应液加10yL，无RNA酶水加至总体积20yL，37°C15min，85°C5s，4°C保存。[0055]2.2.3荧光定量PCR[0056]VIPRl基因荧光定量PCR上游引物F:5’-CCTCCATTCAAGGCCGCAAT-3’，下游引物R:5’-GCTGCTCATCCAAACTCGCT-3’；GPPDH为内参，上游引物F:5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，下游引物R:5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’反应条件如下：95°C预变性2min，95°C变性158,55°：退火308和72°：延伸308，共40个循环。反应体系为2^1^，其中2以1^〇0嫩，0.8以1^引物，IOyLSYBRPremixExTaqTM和0.4yLR0X，加超纯水补齐至20yL。[0057]2.2.4荧光定量PCR结果[0058]荧光定量PCR结果提示VIPRl在肝癌组织中表达较低，在癌旁组织中表达较高。结果如图7所示。经统计学分析，VIPRl在肝癌组织中的表达显著低于在癌旁组织中的表达P〈0.05〇[0059]实施例3免疫组化验证VIPRl与肝癌的关系[0060]3.1组织来源[0061]肝癌（HCC组织芯片购买自上海芯超生物科技有限公司。HCC组织芯片（HLiv-HCC180Sur-05包含95例HCC组织和85例配对的癌旁组织。手术时间为2006年8月-2011年9月，随访时间截止到2013年9月。随访记录缺失10例。[0062]3.2免疫组织化学（IHC染色[0063]将组织芯片放入烘箱中，温度调至63°C，烘蜡lh。片子烘烤完成后，从烘箱内取出，放入全自动染色机中，进行脱蜡。从染色机中取出片子，用纯水冲洗3次，每次2min。冲洗过程中将柠檬酸修复液放至电磁炉上开始加热;柠檬酸修复液沸腾后，将片子放入高压锅中，盖上高压锅盖，待出气后开始计时，5min后终止加热，将高压锅盖打开，使其自然冷却，将阻断剂滴在片子上，计时IOmin。用I3BS缓冲液冲洗3次，一次Imin;加一抗VIPRl，按体积比1:300稀释，4°C孵育过夜，PBS冲洗3次，每次Imin。加入生物素标记的二抗，室温下孵育30min，PBS冲洗3次，每次lmin。加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育IOmineBS冲洗3次，每次IminAAB显色后苏木素复染，盐酸酒精浸泡3s。用自来水冲洗5min，室温瞭干后封片。[0064]3.3免疫组化染色评分[0065]VIPRl的染色强度评分为0到3,0分表示负，1分表示弱，2分表示中，3分表示强。阳性染色细胞的百分比;评分为0到4,其中1表示百分比为0-25%，2表示百分比为26%-50%，3表示百分比为51%-75%和4表示百分比为76%-100%。阳性染色细胞百分比评分乘以染色强度评分，即为免疫组化染色评分（IRS，IRS值介于0-12。当IRS彡4时，为VIPRl高表达；当IRS〈4时，为VIPRl低表达。[0066]3.4免疫组化结果[0067]免疫组化结果表明VIPRl在肝癌组织中的表达明显低于配对癌旁非肿瘤组织P=0.0058。结果如图8-图12所示。[0068]实施例4VIPRl在肝癌组织的表达与病人临床预后相关[0069]全组85例病人的临床病理特点，经统计分析发现VIPRl的表达与病人的病理组织学分级有关。结果如表1所示。[0070]表IVIPRl表达水平与病人临床病理特征的关系[0071][0072]生存分析发现，肝癌组织中VIPRl高表达的患者生存率较高P=O.0055。结果如图13所示。对于总生存率，单因素分析显示:高VIPRl表达、肿瘤大小高中分化和较低的TNM分期与较高的总生存率相关，多因素分析采用Cox比例风险回归模型，结果显示VIPRl表达水平为肝细胞癌患者生存的独立影响因素;肝癌中VIPRl表达较低者与表达较高者对于死亡的相对危险度HR=1.776，P=0.043。结果如表2所示。[0073]表2单因素和多因素分析病人的临床病理特征与总生存率的关系[0074][0075]表示单因素分析无统计意义的参数未纳入多因素分析。[0076]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种VIPRl基因在制备肝癌诊断产品中的应用。2.根据权利要求1所述的VIPRl基因在制备肝癌诊断产品中的应用，其特征在于，所述肝癌诊断产品包括:通过荧光定量PCR或免疫检测诊断肝癌的产品。3.根据权利要求2所述的VIPRl基因在制备肝癌诊断产品中的应用，其特征在于，所述通过荧光定量PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增VIPRl基因的引物。4.根据权利要求3所述的VIPRl基因在制备肝癌诊断产品中的应用，其特征在于，所述特异扩增VIPRl基因的引物为:上游引物F:5’-CCTCCATTCAAGGCCGCAAT-3’，下游引物R:5’-GCTGCTCATCCAAACTCGCT-3’。5.根据权利要求2所述的VIPRl基因在制备肝癌诊断产品中的应用，其特征在于，所述通过免疫检测诊断肝癌的产品包括:与VIPRl蛋白特异结合的抗体。6.—种VIPRl基因在制备肝癌预后预测产品中的应用。7.根据权利要求6所述的VIPRl基因在制备肝癌预后预测产品中的应用，其特征在于，所述肝癌中VIPRl基因显著低表达，在癌旁和远隔的正常肝细胞中VIPRl基因有较高表达，肝癌组织中VIPRl表达越低者，预后越差。8.—种VIPRl基因在制备治疗肝癌药物中的应用。9.根据权利要求8所述的VIPRl基因在制备治疗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述肝癌中VIPRl基因显著低表达，在癌旁和远隔的正常肝细胞中VIPRl基因有较高表达。

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