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申请/专利权人：浙江大学

摘要：本发明涉及螺旋藻生产技术，旨在提供一种通过RAPD检测鉴别螺旋藻藻丝沥水性能优劣的方法。该方法包括：从培植池取钝顶螺旋藻藻液，用毛细吸管显微分离法挑取长度≥300μm的藻丝单体，培养成藻丝群体；对所得藻丝群体取样，然后进行随机扩增多态性DNA分析与检测；如果最终无法用引物S90扩增出590bp的条带，表明被鉴别藻丝具有良好沥水性能；反之，则表明被鉴别藻丝沥水性能差。本发明的方法基于RAPA技术鉴别螺旋藻藻丝沥水性优劣，与常规方法相比不仅简便、高效，而且成本低，并适合高通量筛检。

主权项：1.一种通过RAPD检测鉴别螺旋藻藻丝沥水性能优劣的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）从培植池取钝顶螺旋藻藻液，用毛细吸管显微分离法挑取长度≥300μm的藻丝单体，培养成藻丝群体；（2）对步骤（1）中所得藻丝群体取样，然后用序列为5’-AGGGCCGTCT-3’的引物S90的进行随机扩增及多态性DNA分析与检测；如果最终无法用引物S90扩增出590bp的条带，表明被鉴别藻丝具有良好沥水性能；反之，则表明被鉴别藻丝沥水性能差。

全文数据：一种通过RAPD检测鉴别螺旋藻藻丝沥水性能优劣的方法技术领域本发明属于螺旋藻生产技术，特别涉及一种通过RAPD检测鉴别螺旋藻藻丝沥水性能优劣的方法。背景技术螺旋藻Spirulina，是一种光合放氧、呈规则螺旋的原核丝状微藻，系蓝藻门Cyanophyta、颤藻目Oscillatoriales、颤藻科Oscillatoriaceae的一个属[武汉植物学研究,1997,154:369-374]。因富含优质蛋白和多种生物活性物质而受到国内外的极大关注，并已在大量研究的基础上形成了庞大的螺旋藻产业，成为目前全球研究开发规模最大，应用前景最广泛的经济微藻。目前国内外螺旋藻粉生产，普遍采用循环式跑道池培养，再用孔径约50μm的滤网过滤采收与清洗藻体，并沥至自然不滴水时，将藻泥喷雾干燥制得干粉。这一工艺虽成熟且已基本实现自动化，但因螺旋藻在培植过程中会因温度、光照、培养液成分等变化，藻丝会发生源于DNA突变的变短、变小、变直、沥水性能变差等多种变异，进而严重影响螺旋藻的采收与干燥[JournalofPhycology,2005,413:622–628]。目前，绝大多数螺旋藻基地藻体采收后沥至自然不滴水时，藻泥的含水量仍高达95％以上，即100kg藻泥干燥所得藻粉不足5kg，干燥1kg藻粉至少需消耗6元的燃油或天然气。如此高的干燥能耗，不仅极大限制了螺旋藻粉作为优质饲料蛋白源在畜禽和水产养殖等需求量更大领域的大规模应用，而且一些生产基地为降低干燥成本而擅自燃烧煤炭甚至柴薪，严重破坏生态、污染环境。为此，国内外近20多年来，一直试图利用连续离心、减压抽滤、吸附交换等脱水工艺，降低螺旋藻藻泥的持水量，但因藻体的沥水性能差、藻细胞的抗机械作用力性能低等原因，而均未能奏效。同时，国内外至今仍沿用“随机分离藻丝单体→培养成藻丝群体→室内转接培养→室外扩大培养→沥水性能检测→用于生产培植”，这一筛选高沥水性能螺旋藻藻丝的传统方法，工序繁琐、耗时长、成功率低，在实际生产应用中收效甚微。因此，有必要建立简便、高效、高通量鉴别螺旋藻藻丝沥水性能优劣的方法，以满足当前国内外螺旋藻产业不断发展的实际需要。发明内容本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种通过RAPD检测鉴别螺旋藻藻丝沥水性能优劣的方法。为解决技术问题，本发明的解决方案是：提供一种通过RAPD检测鉴别螺旋藻藻丝沥水性能优劣的方法，包括以下步骤：1从培植池取钝顶螺旋藻藻液，用毛细吸管显微分离法挑取长度≥300μm的藻丝单体，培养成藻丝群体；2对步骤1中所得藻丝群体取样，然后进行随机扩增多态性DNARandomAmplifiedPolymorphicDNA，简称RAPD分析与检测；如果最终无法用引物S90扩增出590bp的条带，表明被鉴别藻丝具有良好沥水性能；反之，则表明被鉴别藻丝沥水性能差。本发明中，所述步骤1中的培养条件为：以40W日光灯为光源，培养液面的光照强度为54μmolphotons·m-2·d-1；按光照12h和黑暗12h交替的方式控制光照条件，光照时温度28℃、黑暗时温度20℃。本发明中，该方法具体包括：1.1从规模化生产的培植池中取5mL螺旋藻藻液，用毛细吸管显微分离法挑取长度≥300μm的藻丝单体5条，分别置于编号且盛有1.0mLZarrouk培养液的2.0mLEppendorf管中培养25d，培植成藻丝群体；1.2从步骤1.1的每只Eppendorf管中各吸取0.1mL藻液，分别转入编号且盛有1.0mLZarrouk培养液的2.0mLEppendorf管中继续培养；每只Eppendorf管中剩余0.9mL藻液分别用滤纸过滤收集藻体并编号，提取各管藻体的基因组DNA；1.3分别利用RAPD技术对步骤1.2过滤收集到的藻体的基因组DNA进行多态性分析，如果最终无法用引物S90扩增出590bp的条带，表明被鉴别藻丝具有良好沥水性能；反之，则表明被鉴别藻丝沥水性能差；1.4根据步骤1.3的鉴定结果，从步骤1.2继续培养的藻丝中，挑选出沥水性能好的藻丝的Eppendorf管，将其中的藻丝用于工厂化培植生产。本发明中，所述步骤1.3中的RAPD技术具体包括：2.1随机引物S90的序列为5’-AGGGCCGTCT-3’；25μLPCR反应体系中含10倍的PCR缓冲液2.5μL、4种dNTP各1μmolL、随机引物0.5μmolL、2.5U的TaqDNA聚合酶、100ng基因组DNA；PCR反应程序为94℃5min、94℃30s、36℃1min、72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min；2.2将步骤2.1中的扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，电压4Vcm；电泳完后用EB染色30min，再在VersaDocTMImagingSystem3000凝胶成像系统Bio-Rad，USA观察并照相。发明原理描述：业界对于螺旋藻藻丝沥水性能变差的内在本质原因还不清楚，也尚无彻底抑制其变差的方法。申请人经多年的研究发现，这些使藻种生产性状退化的表型变化大多源于DNA突变。如螺旋藻藻丝的沥水性能一旦变差后，其基因组DNA对引物S90的扩增产物中就会多出一条590bp的条带。本发明正是基于这一发现，建立螺旋藻藻丝沥水性能优劣的鉴别方法。与现有技术相比，本发明的显著优点：本发明的方法基于RAPA技术鉴别螺旋藻藻丝沥水性优劣，与常规方法相比不仅简便、高效，而且成本低，并适合高通量筛检。附图说明图1为从大规模培植池钝顶螺旋藻品系Sp-3藻液中，分离出5条藻丝单体培养成藻丝群体后，所作的扩增条带的电泳图；其中，M为分子量标准；CK为阴性对照；1～5为藻丝单体的管号。图2为从大规模培植池钝顶螺旋藻品系Sp-4藻液中，分离出5条藻丝单体培养成藻丝群体后，所作的扩增条带的电泳图；其中，M为分子量标准；CK为阴性对照；1～5为藻丝单体的管号。图3为从大规模培植池钝顶螺旋藻品系Sp-14藻液中，分离出5条藻丝单体培养成藻丝群体后，所作的扩增条带的电泳图；其中，M为分子量标准；CK为阴性对照；1～5为藻丝单体的管号。具体实施方式下面结合具体实施例子，对本发明的技术方案进行详细说明。1、选用样本材料：使用公知的3株广泛应用于大规模生产培植的钝顶螺旋藻品系Sp-3、Sp-4、Sp-15，在申请人下属的浙江大学原子核农业科学研究所也有保存。申请人保证，在专利有效期内可按需要向社会公众提供样本。2、试剂和仪器：过滤用滤纸由杭州沃华滤纸有限公司生产；TaqDNA聚合酶和琼脂糖为上海生工生物工程公司产品；dNTP、DNA限制性内切酶、RNaseA均为日本TaKaRa公司产品；PCR随机引物S90的序列为5’-AGGGCCGTCT-3’，由上海英骏公司合成；其它试剂均为分析纯；序列扩增用美国Hybaid公司的ThermalCyclerPCR仪；观察和测定藻丝形态用日本Olympus公司带DP-73的BX-53型光学显微镜。3、鉴别螺旋藻藻丝沥水性能优劣的方法如下：1从大规模培植池取钝顶螺旋藻品系Sp-3的藻液5mL，用毛细吸管显微分离法参见浙江农业学报,1998,105:275–277挑取长度≥300μm的藻丝单体5条，分别置于盛有1.0mLZarrouk’s培养液的2.0mLEppendorf管中培养，并编上管号；2以40W日光灯为光源，将步骤1中的藻丝单体置于光照强度54μmolphotons·m-2·d-1；按光照12h和黑暗12h交替的方式控制光照条件，光照时温度28℃、黑暗时温度20℃。3从步骤2的每只Eppendorf管中各吸取0.1mL藻液，分别转入编号且盛有1.0mLZarrouk’s培养液的2.0mLEppendorf管中继续培养，每只Eppendorf管中剩余0.9mL藻液分别用滤纸过滤收集藻体并编号，分别提取5管藻体的基因组DNA；4采用RAPD检测技术对步骤3中过滤收集到的藻体的基因组DNA作多态性分析，分析条件为：随机引物S90的序列为5’-AGGGCCGTCT-3’，25μLPCR反应体系中含10倍的PCR缓冲液2.5μL、4种dNTP各1μmolL、随机引物0.5μmolL、2.5U的TaqDNA聚合酶、100ng基因组DNA，PCR反应程序为94℃5min、94℃30s、36℃1min、72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min；5将步骤4的扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，电压4Vcm，电泳完后用EB染色约30min，再在VersaDocTMImagingSystem3000凝胶成像系统Bio-Rad,USA观察并照相，经过观察，如果被鉴别的螺旋藻藻丝用引物S90扩增不出590bp的条带，则表明沥水性能好，反之则差。6根据步骤5中仅1和4号管藻体基因组DNA的扩增产物不含590bp的条带图1，即步骤3继续培养的1和4号管中的藻丝，为沥水性能好的藻丝。4、结果与分析将上述通过挑取藻丝单体培养获得的5管Sp-3藻丝群体，用传统方法分别进行室内转接培养、室外扩大培养及沥水性能检测。结果显示，1～5藻丝对应藻泥的含水量依次为94.2％、97.6％、97.9％、94.7％、97.4％。即采用本发明方法鉴别出的高沥水性藻丝1和4，可使藻泥的含固量比低沥水性藻丝的至少提高了1.04倍，沥水性能显著高于其它藻丝。作为验证的实例1，申请人从大规模培植池取钝顶螺旋藻品系Sp-4的藻液5mL，用毛细吸管显微分离法挑取长度≥300μm的藻丝单体5条，培养成藻丝群体后，经RAPD检测，仅3号管藻体基因组DNA的扩增产物不含590bp的条带图2。将这5管Sp-4藻丝群体，用传统方法分别进行室内转接培养、室外扩大培养及沥水性能检测。结果显示，1～5藻丝对应藻泥的含水量依次为97.7％、97.1％、94.6％、97.5％、97.9％。即采用本专利方法鉴别出的高沥水性藻丝3，可使藻泥的含固量比低沥水性藻丝的至少提高了86.2％，沥水性能显著高于其它藻丝。作为验证的实例2，申请人从大规模培植池取钝顶螺旋藻品系Sp-15的藻液5mL，用毛细吸管显微分离法挑取长度≥300μm的藻丝单体5条，培养成藻丝群体后，经RAPD检测，仅4号管藻体基因组DNA的扩增产物不含590bp的条带图3。将这5管Sp-4藻丝群体，用传统方法分别进行室内转接培养、室外扩大培养及沥水性能检测。结果显示，1～5藻丝对应藻泥的含水量依次为97.2％、97.8％、96.9％、94.2％、97.3％。即采用本发明方法鉴别出的高沥水性藻丝3，可使藻泥的含固量比低沥水性藻丝的至少提高了1.07倍，沥水性能显著高于其它藻丝。上述例子进一步说明，本发明建立的简便、高效、高通量鉴别螺旋藻藻丝沥水性能优劣的方法是可行的。序列表浙江大学一种通过RAPD检测鉴别螺旋藻藻丝沥水性能优劣的方法1SIPOSequenceListing1.0110DNA人工序列Artificialsequence1agggccgtct10

权利要求：1.一种通过RAPD检测鉴别螺旋藻藻丝沥水性能优劣的方法，其特征在于，包括以下步骤：1从培植池取钝顶螺旋藻藻液，用毛细吸管显微分离法挑取长度≥300μm的藻丝单体，培养成藻丝群体；2对步骤1中所得藻丝群体取样，然后进行随机扩增多态性DNA分析与检测；如果最终无法用引物S90扩增出590bp的条带，表明被鉴别藻丝具有良好沥水性能；反之，则表明被鉴别藻丝沥水性能差。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中培养条件为：以40W日光灯为光源，光照强度54μmolphotons·m-2·d-1，按光照12h和黑暗12h交替的方式控制光照条件，光照时温度28℃、黑暗时温度20℃。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法具体包括：1.1从规模化生产的培植池中取5mL螺旋藻藻液，用毛细吸管显微分离法挑取长度≥300μm的藻丝单体5条，分别置于编号且盛有1.0mLZarrouk培养液的2.0mLEppendorf管中培养25d，培植成藻丝群体；1.2从步骤1.1的每只Eppendorf管中各吸取0.1mL藻液，分别转入编号且盛有1.0mLZarrouk培养液的2.0mLEppendorf管中继续培养；每只Eppendorf管中剩余0.9mL藻液分别用滤纸过滤收集藻体并编号，提取各管藻体的基因组DNA；1.3分别利用RAPD技术对步骤1.2过滤收集到的藻体的基因组DNA进行多态性分析，如果最终无法用引物S90扩增出590bp的条带，表明被鉴别藻丝具有良好沥水性能；反之，则表明被鉴别藻丝沥水性能差；1.4根据步骤1.3的鉴定结果，从步骤1.2继续培养的藻丝中，挑选出沥水性能好的藻丝的Eppendorf管，将其中的藻丝用于工厂化培植生产。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1.3中的RAPD技术具体包括：2.1随机引物S90的序列为5’-AGGGCCGTCT-3’；25μLPCR反应体系中含10倍的PCR缓冲液2.5μL、4种dNTP各1μmolL、随机引物0.5μmolL、2.5U的TaqDNA聚合酶、100ng基因组DNA；PCR反应程序为94℃5min、94℃30s、36℃1min、72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min；2.2将步骤2.1中的扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，电压4Vcm；电泳完后用EB染色30min，再在VersaDocTMImagingSystem3000凝胶成像系统观察并照相。

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