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申请/专利权人：中山大学

摘要：本发明公开了一株阔苞菊内生真菌CYSK‑4及其生产的Ascomylactam类化合物的应用。CYSK‑4菌株于2016年11月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCCNo:60100。CYSK‑4菌株能分泌产生一类特殊结构的Ascomylactam类化合物，Ascomylactam类化合物的结构式如式Ⅰ和式Ⅱ所示。式Ⅰ和式Ⅱ所示的Ascomylactam类化合物能有效抑制人乳腺癌细胞株MDA‑MB‑435、人肝癌细胞株HepG2、人结肠癌细胞株HCT116、人肺癌细胞株H460，在抗肿瘤药物制备领域具有良好的应用前景。

主权项：1.一株阔苞菊内生真菌Ascomycotasp.CYSK-4，其特征在于，所述菌株于2016年11月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心GDMCC，保藏编号为GDMCCNo:60100。

全文数据：一株阔萑菊内生真菌CYSK-4及其生产的AscomyIactam类化合物的应用技术领域[0001]本发明涉及药物化合物领域，具体地涉及一株阔苞菊内生真菌CYSK-4及其生产的Ascomylactam类化合物的应用。背景技术[0002]红树林是分布于热带、亚热带海岸潮间带的木本植物群落。它孕育了丰富的微生物资源，目前已分离鉴定的红树林真菌超过290种，已成为海洋真菌的第二大类群。红树林植物生长在高度盐渍化、土壤缺氧、高光辐射及周期性的海水浸淹的环境中，使其具备了独特的代谢机制，其内生真菌能产生结构新颖的活性代谢产物，是小分子药物活性先导物的重要来源。[0003]另外，红树林植物是一种海洋高等植物，不仅具有护堤、净化海水等生态价值，同样是海洋药物开发和新药研究的主要药源之一。其特殊的生态环境，使其内生真菌更为独特，且海洋微生物可以利用现代微生物发酵工程技术进行再生产，无原材料后顾之忧，不会破坏生态平衡，易实现产业化等优势，使得对红树林药用价值的研究更为方便。阔苞菊PlucheaindicaLess.属于半红树植物，既能在潮间带生存，又能在陆地环境中自然繁殖的两栖木本植物，同时该植物具有化气、去湿、消坚散核的功能。目前，还未见从阔苞菊中分离获得内生真菌的报道。发明内容[0004]本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一株阔苞菊内生真菌Ascomycotasp.CYSK-4〇[0005]本发明的另一目的是提供上述阔荀菊内生真菌Ascomycotasp.CYSK-4生产的Ascomylactam类化合物。[0006]本发明的另一目的是提供上述阔荀菊内生真菌Ascomycotasp.CYSK-4生产的Ascomylactam类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。[0007]为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：[0008]一株阔荀菊内生真菌Ascomycotasp·CYSK-4，所述菌株于2016年11月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心GDMCC，保藏编号为GDMCCNo:60100。保藏单位的地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，菌株分类命名为Ascomycotasp.。[0009]上述阔荀菊内生真菌Ascomycotasp.CYSK-4分离自广西山口红树林保护区内半红树植物阔荀菊的树枝部分，经ITSrRNA鉴定为子囊菌属Ascomycotasp.真菌，该菌株的ITSrDNA序列如SEQIDNO.1所示。该菌株的生物学特征为:在PDA培养基上，20〜25°C恒温培养时，菌落表面为军绿色短绒毛状，背面为黄褐色，扩散性生长，有孢子生成，为好氧型真菌。[0010]阔荀菊内生真菌Ascomycotasp.CYSK-4能分泌产生一类特殊结构的Ascomylactam类化合物，所述Ascomylactam类化合物的结构式如式I和式Π所示：[0011][0012]作为优选实施方案，如上所述的Ascomylactam类化合物的制备方法，包括如下步骤:将所述的阔苞菊内生真菌Ascomycotasp.CYSK-4在大米固体培养基中，25°C静置培养一个月，向培养液中加入甲醇溶剂浸泡，提取2〜3遍，旋蒸浓缩提取液，将浸膏用硅胶柱层析进行分离，分离用10%、20%、30%、40%、50%、60%、100%的乙酸乙酯石油醚梯度淋洗，收集20%〜60%乙酸乙酯石油醚洗脱液，将30%的乙酸乙酯石油醚的洗脱液，用硅胶柱层析分离，再以凝胶SephadexLH-20层析，用体积比为1:1的甲醇-氯仿为洗脱剂进行洗脱层析分离，重结晶纯化，即得到白色晶体化合物AscomylactamA和AscomylactamB0[0013]作为优选实施方案，如上所述的Ascomylactam类化合物的制备方法，包括如下步骤:将所述的阔荀菊内生真菌Ascomycotasp.CYSK-4在马铃薯葡萄糖液体培养基中，25°C静置培养一个月，将菌体和菌液过滤分离，菌液直接用乙酸乙酯萃取，萃取三遍后收集浓缩，同时将菌体晾干后用甲醇浸泡提取，浸泡三遍后收集浓缩，并将液体收集浓缩的浸膏合并，该浸膏经硅胶柱层析进行分离，分别用10%，20%，30%，40%，50%，60%，100%的乙酸乙酯-石油醚梯度淋洗，分成30组分，其中第20组分，先用硅胶柱层析分离，30%乙酸乙酯-石油醚为洗脱剂，再采用葡聚糖凝胶SephadexLH-20层析，用体积比为1:1的甲醇-氯仿为洗脱剂进行洗脱，最终获得化合物AscomylactamA和AscomylactamB0[0014]如上所述的Ascomylactam类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。[0015]优选地，所述的抗肿瘤药物为抗乳腺癌药物、抗肝癌药物、抗结肠癌药物、抗肺癌药物。[0016]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：[0017]本发明从广西山口半红树植物阔苞菊中分离获得一株阔苞菊内生真菌Ascomycotasp.CYSK-4，CYSK_4菌株能分泌产生一类特殊结构的Ascomylactam类化合物，Ascomylactam类化合物的结构式如式I和式Π所示。式I和式Π所示的Ascomylactam类化合物能有效抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-435、人肝癌细胞株HepG2、人结肠癌细胞株HCTl16、人肺癌细胞株H460,在抗肿瘤药物制备领域具有良好的应用前景。[0018]另外，阔荀菊内生真菌Ascomycotasp.CYSK-4发酵工艺简单，生产活性化合物的成本低，节能环保，是开发新型天然药物的一种理想载体；阔荀菊内生真菌Ascomycotasp.CYSK-4发酵和生产活性化合物的周期短，分离制备较简单，易于扩大生产，适用于大规模生产。附图说明[0019]图1为发明AscomylactamA化合物的高分辨质谱[0020]图2为发明AscomylactamA化合物的核磁共振氢谱。[0021]图3为发明AscomylactamA化合物的核磁共振碳谱。[0022]图4为发明AscomylactamA化合物的H,H-COSY二维谱。[0023]图5为发明AscomylactamA化合物的HSQC二维谱。[0024]图6为发明AscomylactamA化合物的HMBC二维谱。[0025]图7为发明AscomylactamA化合物的NOESY二维谱。[0026]图8为发明AscomylactamB化合物的高分辨质谱[0027]图9为发明AscomylactamB化合物的核磁共振氢谱。[0028]图10为发明AscomylactamB化合物的核磁共振碳谱。[0029]图11为发明AscomylactamB化合物的H,H-COSY二维谱。[0030]图12为发明AscomylactamB化合物的HSQC二维谱。[0031]图13为发明AscomylactamB化合物的HMBC二维谱。[0032]图14为发明AscomylactamB化合物的NOESY二维谱。具体实施方式[0033]下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法;所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。[0034]实施例1[0035]阔苞菊内生真菌CYSK-4的分离鉴定[0036]1、菌株的分离：阔苞菊采自中国广西省山口红树林保护区。通过对该红树植物的树枝部分清洗、消毒，切成小段，无菌条件下接种到孟加拉红培养基和HM培养基，室温培养下通过多次纯化得到单一菌落。所得到的单一菌落采用普通PDA培养基斜面4°C保藏。CYSK-4菌落表面形态为军绿色短绒毛状，背面为黄褐色。[0037]2、菌株的鉴定:采用CTAB法提取上述分离得到的红树林内生真菌单菌落的纯培养的DNA，采用ITS间隔区的一对引物ITSlF和ITS4通过PCR扩增仪扩增ITS-rRNA基因片段，反应体系为50yL，反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性40s，52°C退火40s，72°C延伸lmin，重复变性、退火和延伸三个步骤30个循环，最后72°C延伸补齐lOmin。通过葡萄糖凝胶电泳检测确定目标片段在600bp左右，通过测序得出菌株的ITS-rRNA基因片段序列（SEQIDNO:1所示），在GenBank上通过BLAST在线比对搜索引擎对序列进行相似性分析，得到最大相似度为99%的菌株，确定菌株为Ascomycotasp.属的真菌，命名为Ascomycotasp.CYSK-4,所述菌株于2016年11月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC，保藏编号为GDMCCNo:60100。保藏单位的地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，菌株分类命名为Ascomycotasp.〇[0038]实施例2[0039]Ascomylactam类化合物的提取、分离纯化[0040]1、种子液的制备：采用马铃薯葡萄糖水PDB，以24glL水比例制取培养基，经过高压灭菌，冷却后，在无菌操作台下将真菌接入到种子液培养基中，放入摇床，所述摇床培养条件为:转速200rpm，温度28°C，培养时间72h。[0041]2、分离纯化:包括两种方案：[0042]方案1:采用大米固体培养基，在盛有大米固体培养基的锥形瓶中倒入种子液，25°：静置培养一个月。在锥形瓶中加入甲醇溶剂浸泡，提取2〜3遍，旋蒸浓缩提取液。将浸膏用硅胶柱层析进行分离，分离用10%、20%、30%、40%、50%、60%、100%的乙酸乙酯石油醚梯度淋洗。收集20%〜60%乙酸乙酯石油醚洗脱液，将30%的乙酸乙酯石油醚的洗脱液，用硅胶柱层析分离，再以凝胶SephadexLH-20层析，用体积比为1:1的甲醇-氯仿为洗脱剂进行洗脱层析分离，重结晶纯化，即得到白色晶体化合物AscomylactamA和AscomylactamB0[0043]方案2:采用马铃薯葡萄糖液体培养基，经过高压灭菌，在装有马铃薯液体培养基的锥形瓶中接入种子液，25°C静置培养一个月。将菌体和菌液用纱布过滤分离，菌液直接用乙酸乙酯萃取，萃取三遍后收集浓缩。同时将菌体晾干后用甲醇浸泡提取，浸泡三遍后收集浓缩，并将液体收集浓缩的浸膏合并。该浸膏经硅胶柱层析进行分离，分别用10%，20%，30%，40%，50%，60%，100%的乙酸乙酯-石油醚梯度淋洗，分成30组分。其中第20组分，先用娃胶柱层析分离，30%乙酸乙酯-石油醚为洗脱剂，再采用葡聚糖凝胶SephadexLH-20层析，用体积比为1:1的甲醇-氯仿为洗脱剂进行洗脱，最终获得化合物AscomylactamA和AscomylactamB0[0044]3、化合物结构鉴定:化合物经核磁共振氢谱、碳谱、H-H⑶图分析，再通过高分辨质谱、红外等确定化合物AscomyIactamA和AscomylactamB的结构，并通过X-ray单晶衍射确定化合物AscomylactamA的绝对构型（晶体数据见表1，通过ECD计算确定化合物AscomylactamB的绝对构型。化合物AscomylactamA的结构如式I所示，AscornyIactamB的的结构如式Π所示，具体数据见图1〜14。[0045]表1为化合物AscomylactamA的晶体数据[0046][0047][0048]实施例3[0049]化合物AscomylactamA和AscomylactamB的活性测试:化合物的抗癌活性测试采用MTT法（方法参考：MosmannT.Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival!applicationtoproliferationandcytotoxicityassays[J].Journalofimmunologicalmethods,1983,651-2:55-63.[0050]1、材料：[0051]I·I、四唑化合物MTS:[0052]3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-5-3-carboxymethoxyphenyl~2~4-sulfophenyl-2H-tetrazolium,CelITiter96AqueousOneSolutionReagent,Promega,USA〇[0053]1.2、靶细胞的制备：人乳腺癌细胞株MDA-MB-435，人肝癌细胞株HepG2，人结肠癌细胞株HCTl16和人肺癌细胞株H460的复苏与培养。[0054]a.从液氮罐中取出人乳腺癌细胞株MDA-MB-435，人肝癌细胞株HepG2，人结肠癌细胞株HCTl16，人肺癌细胞株H460和人正常细胞MCFlOA的冻存管，迅速置入37°C水浴箱中，不停摇动使之迅速溶化，无菌操作移入离心管中；[0055]b.向人乳腺癌细胞株MDA-MB-435，人肝癌细胞株HepG2，人结肠癌细胞株HCTl16，人肺癌细胞株H460加入DMEM完全培养液至10mL，IOOOrmp离心5min，弃上清;而人正常细胞MCF10A则加入RPMI-1640培养液至10mL，IOOOrmp离心5min，弃上清；[0056]c·重复以上操作一次；[0057]d.人乳腺癌细胞株MDA-MB-435，人肝癌细胞株HepG2，人结肠癌细胞株HCTl16，人肺癌细胞株H460完全培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中，5%CO2，37°C培养;而人正常细胞MCF10A则加入RPMI-1640培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中，5%⑶2,37°C条件下培养；[0058]e.观察细胞生长情况，及时更换培养液，分瓶。[0059]1.3、细胞计数[0060]a.选取对数生长期细胞，胰酶消化，培养基终止，移入离心管中，加培养基至IOmL;[0061]b.取10μ1细胞悬液滴入计数板一侧凹槽中，显微镜下计数四大格的细胞总数、除以4，乘IO4，即为每毫升培养液所含细胞数；[0062]c·调整细胞数至IX105mL。[0063]1.4、化合物的配制：取生物碱化合物1加入到DMEM完全培养基中，调整浓度为500μmolmL，超声乳化，过滤除菌，4°C保存。[0064]2、试验方法:具体包括如下步骤。[0065]1在96孔板的各孔中分别加入50yL的细胞浓度为IXIOVmL的人乳腺癌细胞株MDA-MB-435、人肝癌细胞株HepG2、人结肠癌细胞株HCTl16、人肺癌细胞株H460和人正常细胞10?1^，在5%02,37°：条件下培养1211。[0066]2加入不同浓度受试对象50yL，对照加DMEM完全培养基50yL，继续培养72h。[0067]3加入MTSCellTiter96AqueousOneSolutionReagent，Promega，USA各10μL，继续培养Ih。[0068]4酶标仪TECAN，Switzerland490nm下测定每孔OD值。[0069]5按照下列公式计算受试对象的抑制率：[0070]肿瘤细胞杀伤率％=[对照组测定的平均OD值一加药组测定的平均OD值对照组测定的平均㈤值]X100%。[0071]⑹以抑制率对药物浓度的对数作图，求得IC5O值；以Igc为横坐标，抑制率为纵坐标，求得IC5Q值。[0072]3、试验结果：结果显示生物碱类化合物AscomylactamA和AscomylactamB能有效抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-435，人肝癌细胞株HepG2，人结肠癌细胞株HCTl16，人肺癌细胞株H460，AscomylactamA和AscomylactamB抑制各种肿瘤细胞株的IC5Q值μΜ见表2〇[0073]表2为化合物抑制各种肿瘤细胞株的1：50值[0074]

权利要求：1.一株阔荀菊内生真菌iscoffiycotasp.CYSK-4,其特征在于，所述菌株于2016年11月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心GDMCC，保藏编号为GDMCCNo:60100。2.权利要求1所述阔荀菊内生真菌Xsco野cotasp·CYSK-4分泌产生的Ascomylactam类化合物，其特征在于，所述Ascomylactam类化合物的结构式如式I和式Π所示：3.权利要求2所述的Ascomylactam类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的阔苞菊内生真菌Xsco^cotasp.CYSK-4在大米固体培养基中，25°C静置培养一个月，向培养液中加入甲醇溶剂浸泡，提取2〜3遍，旋蒸浓缩提取液，将浸膏用硅胶柱层析进行分离，分离用10%、20%、30%、40%、50%、60%、100%的乙酸乙酯石油醚梯度淋洗，收集20%〜60%乙酸乙酯石油醚洗脱液，将30%的乙酸乙酯石油醚的洗脱液，用硅胶柱层析分离，再以凝胶SephadexLH-20层析，用体积比为1:1的甲醇-氯仿为洗脱剂进行洗脱层析分离，重结晶纯化，即得到白色晶体化合物AscomylactamA和AscomylactamB04.权利要求2所述的Ascomylactam类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的阔荀菊内生真菌Xsconycoiasp.CYSK-4在马铃薯葡萄糖液体培养基中，25°C静置培养一个月，将菌体和菌液过滤分离，菌液直接用乙酸乙酯萃取，萃取三遍后收集浓缩，同时将菌体晾干后用甲醇浸泡提取，浸泡三遍后收集浓缩，并将液体收集浓缩的浸膏合并，该浸膏经硅胶柱层析进行分离，分别用10%，20%，30%，40%，50%，60%，100%的乙酸乙酯-石油醚梯度淋洗，分成30组分，其中第20组分，先用硅胶柱层析分离，30%乙酸乙酯-石油醚为洗脱剂，再采用葡聚糖凝胶SephadexLH-20层析，用体积比为1:1的甲醇-氯仿为洗脱剂进行洗脱，最终获得化合物AscomylactamA和AscomylactamB。5.权利要求2所述的Ascomylactam类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为抗乳腺癌药物、抗肝癌药物、抗结肠癌药物、抗肺癌药物。

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