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申请/专利权人：上海交通大学

摘要：本发明提供了一种鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：S1、设计针对鸡TBK1的两条干扰靶序列；S2、根据步骤S1设计的两条干扰靶序列，分别合成用于构建shRNA片段的两组互补的单链DNA序列，并分别在所述两组互补的单链DNA序列中引入相应的酶切位点；S3、将所述两组互补的单链DNA序列分别经变性退火后，分别形成带有黏末端的双链DNA片段；然后，分别将所述双链DNA片段与载体连接，得到所述鸡TBK1基因的小干扰RNA。我们通过细胞水平实验，证实本发明构建的靶向鸡TBK1小干扰RNA的干扰质粒能高效特异性抑制鸡TBK1基因的表达，为深入研究TBK1在鸡抗病毒先天免疫中的作用提供了平台。

主权项：1.一种鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：S1、设计针对鸡TBK1的两条干扰RNA靶序列；所述两条干扰靶序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示：SEQIDNO.1：GGACAAGGAGCTACTGCAAAT；SEQIDNO.2：GCAGATGACCTTGCACAAAGT；S2、根据步骤S1设计的两条干扰RNA靶序列，分别合成用于构建shRNA片段的两组互补的单链DNA序列，并分别在所述两组互补的单链DNA序列中引入相应的酶切位点；S3、将所述两组互补的单链DNA序列分别经变性退火后，分别形成带有黏末端的双链DNA片段；然后，分别将所述双链DNA片段与载体连接，得到所述鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒；步骤S3中，所述载体为pGPU6-Neo质粒；其中，步骤S2中，当干扰靶序列如SEQIDNO.1所示时，所述互补的单链DNA序列为：正义链：GGACAAGGAGCTACTGCAAATttcaagagaATTTGCAGTAGCTCCTTGTCCTTTTTTG，如SEQIDNO.3所示，反义链：CCAAAAAAGGACAAGGAGCTACTGCAAATtctcttgaaATTTGCAGTAGCTCCTTGTCC，如SEQIDNO.4所示；当干扰靶序列如SEQIDNO.2所示时，所述互补的单链DNA序列为：正义链：GCAGATGACCTTGCACAAAGTttcaagagaACTTTGTGCAAGGTCATCTGC，如SEQIDNO.5所示，反义链：CCAAAAAAGCAGATGACCTTGCACAAAGTtctcttgaaACTTTGTGCAAGGTCATCTGC，如SEQIDNO.6所示。

全文数据：鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒的构建方法及用途技术领域[0001]本发明涉及靶向鸡源TANK结合激酶1TANKbindingkinase-l，TBKl基因的小干扰RNA质粒的构建方法。具体地，涉及一种鸡TBK1基因小千扰RNA质粒的构建方法及用途。背景技术[0002]在理想情况下，机体的天然免疫能够成功阻挡病毒的入侵，但是病毒也能通过各种方式例如病毒基因突变等成功逃逸机体的先天免疫机制，病毒与机体两者之间总是在不断的对抗，共同进化。据研究报道，很多病毒蛋白都能够通过作用于TBK1逃逸先天抗病毒免疫反应。例如，鼠肝炎病毒A59、牛痘病毒、旱懒病毒、疱疹病毒等。近年来，随着家禽业的发展，滥用兽药现象逐年递增，病毒毒力也不断増强，免疫抑制的情况时常发生。因此，从遗传水平上改良家禽的抗病力，寻求与抗病毒密切相关的核心基因是家禽育种上的新挑战。[0003]TBK1，即TANK结合激酶1TANKbindingkinase-1，又称为NAKNF-kBactivatingkinase，属于非经典IkB相关激酶家族，是一种丝氨酸苏氨酸激酶。TBK1具有诸多生物学功能，如参与炎性反应、细胞凋亡和先天免疫等，也是控制病毒性感染以及治疗诸多疾病如神经性炎症、自身免疫疾病、肿瘤性疾病的潜在药物治疗靶点。TBK1是先天免疫模式识别受体信号转导通路上的核心蛋白，在先天免疫中占据着重要的位置:一方面TBK1是先天免疫的主要模式识别受体TLRs、RLRs和DNA受体信号转导通路上的节点基因，通路的病源刺激信息都会汇集于TBK1;另一方面TBK1是激活转录因子IRF3诱导干扰素产生，促进机体启动免疫状态的关键基因。所以TBK1作为核心基因，构建其干扰质粒，对研究机体与病毒的相互作用方面起到重要作用。在此基础上，本实验室研究发现，在细胞水平上，鸡TBK1基因被干扰后，抗流感病毒和新城疫病毒的感染降低。目前，有研究报道称该基因参与鸡抗病毒先天免疫的作用，但是具体发挥怎样的作用尚未有深入研究。[0004]RNA干扰技术是使目的基因沉默的有力手段，通过人工导入一段与目的基因同源的双链RNA序列，使其mRNA降解，基因表达缺失，从而实现基因敲除。目前实验室进行RNA干扰常用的小干扰RNAsmallinterferingRNA，siRNA片段来源主要有两种，一是细胞外化学合成的siRNA，二是细胞内合成的siRNA。细胞外人工化学合成制备的siRNA，一般是先合成两条21〜23nt的正义链和反义链，在体外适当条件下使互补链配对形成siRNA，再通过不同的方法如转染、点打孔等将siRNA导入细胞，诱导RNA干扰。此方法虽然操作方便，但是干扰效率不高，而且干扰效应瞬时，难以持久。细胞内合成的^1^4包括以质粒为载体的细胞内合成和以病毒为载体的细胞内合成。经改造的质粒和病毒为载体的小干扰RNA片段可较长时间在真核细胞内表达。发明内容[0005]针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒的构建方法及用途，包括提供一种鸡TBK1的小干扰RNA的设计、表达载体的构建及其用途。[0006]本发明利用pGRJ6-Neo质粒为载体在细胞内表达shRNA，并通过细胞水平实验，证实鸡TBKlshRNA干扰质粒可以有效抑制鸡TBK1基因的表达。[0007]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：[0008]第一方面，本发明提供一种鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：[0009]S1、设计针对鸡TBK1的两条干扰RNA靶序列；[0010]S2、根据步骤S1设计的两条干扰RNA靶序列，分别合成用于构建shRNA片段的两组互补的单链DNA序列，并分别在所述两组互补的单链DNA序列中引入相应的酶切位点；[0011]S3、将所述两组互补的单链DNA序列分别经变性退火后，分别形成带有黏末端的双链DNA片段;然后，分别将所述双链DNA片段与载体连接，得到所述鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒。[0012]优选地，步骤S1中，所述两条干扰靶序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示：[0013]SEQIDN0.1：GGACAAGGAGCTACTGCAAAT；[0014]SEQIDN0.2：GCAGATGACCTTGCACAAAGT〇[0015]优选地，步骤S2中，当干扰靶序列如SEQIDN0_1所示时，所述互补的单链DNA序列为：[0016][0017]ATTTGCAGTAGCTCCTTGTCCTTTTTTGj[]SEQIDN0.3m*，[0018]反义链:CCAAAAAAGGACAAGGAGCTACTGCAMTtctcttgaa[0019]ATTTGCAGTAGCTCCTTGTCCjnSEQIDN0.4K*;[0020]当干扰靶序列如SEQIDNO.2所示时，所述互补的单链DNA序列为：[0021][0022]ACTTTGTGCAAGGTCATCTGCjnSEQIDN0.5K*，[0023]反义链:CCAAAAAAGCAGATGACCTTGCACAAAGTtctcttgaa[0024]ACTTTGTGCAAGGTCATCTGCjnSEQIDN0.6K*。[0025]优选地，步骤S3中，所述退火的程序为：90°C4min，70°Cl0min，5TCl5min，37r20min，lCTClOmin。[0026]优选地，步骤S3中，所述载体为pGPU6-Neo质粒。因此，步骤S3最后得到两种PGPU6-shTBKl质粒。[0027]第二方面，本发明提供一种根据所述构建方法得到的鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒。[0028]第三方面，本发明提供一种鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒在制备Tffil信号转导通路的禽病毒性疾病的细胞模型中的应用;所述禽病毒性疾病包括禽流感病毒、新城疫病毒、禽白血病病毒中的至少一种。该干扰质粒也为研宄病毒感染与宿主细胞TBK1之间的相互作用关系提供有用的工具，在筛选抗病毒新型分子药物提供基础的用途。[0029]第四方面，本发明提供一种鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒转染细胞的方法，包括如下步骤:利用脂质体将所述鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒转染细胞。[0030]优选地，在转染前，所述细胞用含10%胎牛血清、100UmL青霉素、100UmL链霉素的DMEM培养基于37°C、5%⑶2的培养箱中进行培养；同时，转染前24h将所述细胞接种于细胞瓶中，接种密度以转染时细胞生长至70%〜90%丰度;所述细胞为DF-1细胞。[0031]优选地，所述转染的步骤包括:将所述鸡TBK1基因的小干扰RNApGPU6-shTBKl质粒与DMEM的混和液和所述脂质体与DMEM的混合液混和，室温静置后，再加入到细胞中。[0032]在本发明中，提供一种靶向鸡TBK1基因的siRNA序列构建真核表达质粒pGroe-shTBKl的方法。其中，所述siRNA的真核表达质粒是在PGPU6-Neo真核表达载体的多克隆位点中连接双链DNA片段构建而得。[0033]所述真核表达质粒pGPU6-shTBKl的构建的步骤如下：[0034]a.根据鸡TBK1的mRNA序列，设计合成单链DNA片段，包括：[0035]1通过软件设计的针对鸡TBK1的两条干扰靶序列：[0036]shTBKl-78：GGACAAGGAGCTACTGCAMT[0037]shTBKl-983：GCAGATGACCTTGCACAAAGT[0038]2根据设计的鸡TBK1的靶序列，设计并合成用于表达载体构建的互补的单链DNA序列，DNA序列中引入相应的酶切位点BamHI和Bbsl，DNA序列如下：[0039]pGPU6-shTBKl-78中：[0040][0041]ATTTGCAGTAGCTCCTTGTCCTTTTTTG[0042]反义链:CCAAAAAAGGACAAGGAGCTACTGCAAATtctcttgaa[0043]ATTTGCAGTAGCTCCTTGTCC[0044]pGPU6-shTBKl-983中：[0045]正义链:GCAGATGACCTTGCACAAAGTttcaagaga[0046]ACTTTGTGCAAGGTCATCTGC[0047]反义链:CCAAAAAAGCAGATGACCTTGCACAAAGTtctcttgaa[0048]ACTTTGTGCAAGGTCATCTGC[0049]b.然后将所述的单链DNA互补得到的双链DNA片段经变性退火后，连接到PGPU6-Neo真核表达载体的多克隆位点中，构建成pGPU6-shTBKl-78和[0050]pGPU6-shTBKl-983〇[0051]c.用脂质体转染质粒pGPU6-shTBKl-78和pGPU6-shTBKl-983到DF1细胞中，为检测细胞中TBK1基因的抑制效果，用免疫印迹法检测细胞中的TBK1表达情况；再将pGPU6-shTBKl-78和pGPU6-shTBKl-983分别与真核表达质粒TBKl-MyC共转染进DF-1细胞此处所述的真核表达质粒TBKl-Myc为实验室保存的构建质粒，主要构建方法是用PCR法扩增出鸡TBK1基因，再将其连到PCDNA3.卜MyC载体上，该pcDNA3•1-MyC载体是实验室自行将pcDNA3.1通用载体加上MyC标签所构建的载体，带MyC的目的是方便用MyC标签抗体检测蛋白表达水平荧光定量PCR法和免疫印迹法检测TBK1的mRNA水平和蛋白表达水平表达情况。[0052]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：[0053]1、本发明通过设计特定的靶向序列，通过利用pGPU6-Neo质粒为载体在细胞内表达shRNA，得到shRNA片段稳定表达的干扰质粒，该干扰质粒能特异性的抑制TBK1基因的表达。[0054]2、本发明构建的鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒在研宄TBK1在介导的抗病毒天然免疫中扮演的角色起到至关重要的用途，例如在禽流感病毒感染介导的抗病毒天然免疫中，TBK1起到承上启下的作用，但是具体的免疫调控机制不清楚，此时，该干扰质粒在研宄抗流感病毒天然免疫信号通路方面就起到了举足轻重的作用。附图说明[0055]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：[0056]图1为实施例1中针对鸡TBK1的小干扰RNA序列设计图；[0057]图2为本发明使用的pGPU6-Neo质粒图谱；[0058]图3为实施例3中免疫印迹检测转染干扰质粒后即-丨细胞中TBK1的蛋白表达图；[0059]图4为实施例4中荧光定量PCR法检测转染干扰质粒后DF-1细胞中TBK1的mRNA表达图；图4A为转染pGPU6-shTBKl-78、pGPU6-shTBKl-983和shNC后的鸡TBK1的mRNA表达水平图；图4⑻是将鸡TBK1基因分别与pGPU6-shTBKl-78、pGPU6-ShTBKl-983、shNC共转染，鸡TBK1的mRNA表达水平图。具体实施方式[0060]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若千变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。[0061]实施例1靶向鸡TBK1基因的siRNA的真核表达载体的构建[0062]鸡TBK1核苷酸序列如SEQIDN0_7所示。根据在线网站分析，自己设计针对TBK1的小干扰RNA序列，并经BLAST分析确定与其他已知基因没有同源性后，按照pGPU6-Neo载体的说明和要求，针对小干扰RNA序列设计合成了2条相应的DNA序列。图1为本实施例中针对鸡TBK1的小干扰RNA序列设计图，图2为pGPU6-Neo质粒图谱。将序列分别溶于适量的去离子水，按照程序90°C4min，70°ClOmin，50°C15min，37°C20min，10°ClOmin进行退火，开《成带有黏末端的双链DNA片段。将pGPU6_Neo载体用BamHI和Bbsl双酶切后与DNA片段连接，转化大肠杆菌DH5a后在氨苄青霉素筛选下挑取阳性克隆，提取质粒用BamH0PBbsI进行双酶切鉴定，大小正确，且对pGPU6-shTBKl_78质粒和pGPU6-shTBKl-983质粒进行测序，pGPU6-shTBKl-78质粒的测序序列如SEQIDN0_8所示，pGPU6_shTBKl-983质粒的测序序列如SEQID风.9所示，将测序正确的质粒分别命名为?〇?1]6-31^811-784〇131]6-8於811-983。[0063]实施例2细胞培养及转染[00M]DF-1细胞用含10%胎牛血清、100UmL青霉素、100UmL链霉素的DMEM培养基于37°C、5%⑶2的培养箱中常规培养。转染前24h将细胞接种于25T细胞瓶中，接种密度以转染时细胞生长至70%〜90%丰度。分别将3.8ug的质粒pGPU6-shTBIQ-78、pGPU6-shTBK1-983与500uL的DMEM混和，再将12.5uL脂质体与500uLDMEM混合，将两者轻轻混和，室温静置20min，加入细胞中，37°C、5%C02培养箱中常规培养。[0065]实施例3免疫印迹检测[0066]分别将实施例2中转染pGPU6-shTBKl-78、pGPU6_shTBKl-983后的DF-1细胞用蛋白裂解液收集样品，加入SDS上样缓冲液，沸水浴I5min，4。：离心后取上清进行SDS-PAGE，电泳结束后用半干转转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温孵育2h，然后加入1:3000稀释的Myc标签抗体于4°C孵育过夜。用TBST洗膜5次，每次lOmin，加入稀释的辣根过氧化物酶偶联的鼠二抗，室温孵育2h，TBST洗膜5次，每次lOmin，然后将含有辣根过氧化物酶底物的化学试剂滴加到膜上，随即显影。[0067]图3为免疫印迹检测DF-1细胞中TBK1的蛋白表达图，图中M表示蛋白Marker;shNC表示转染shNC的样品（shNC为阴性对照组，阴性对照组就是相对于目的基因实验组来说的，shNC是序列打乱后重新组合所得的阴性对照，用于对比目的基因组的实验效果。）；shNC+TBK1表示shNC和TBK1共转染样品；shTBKl-78表示转染pGPU6-shTBKl-78的样品；shTBKl-983表示转染pGPU6-shTBKl-983的样品；shTBKl-78+TBKl表示共转染pGPU6-shTBKl-78和TBK1的样品；shTBKl-983+TBK1表示共转染pGPU6-shTBKl-983和TBK1的样品。从图3中结果可以看出与shNC对照相比，转染pGPU6-shTBKl-78和pGPU6-shTBKl_983后，鸡TBK1的蛋白表达水平显著下降；与shNC+TBK1对照相比，共转染后的鸡TBK1的蛋白表达量也显示出抑制，说明pGPU6-shTBKl-78、pGPU6-shTBKl-983对TBK1抑制效果显著。[0068]实施例4荧光定量PCR法检测[0069]分别收集实施例2中转染pGPUe-shTBKWSjGinje-shTBKl-gSS后的DF-1细胞，用RNA提取试剂盒提取样品，再用反转录试剂盒将RNA反转成cDNA，再用荧光定量PCR法检测DF-1细胞中TBK1的mRNA表达图。[0070]图4A为转染pGPU6-shTBKl-78、pGPU6-shTBKl-983和shNC后的鸡TBK1的mRNA表达水平，从图中可以看出，与shNC对照相比，转染pGPU6-shTBKl-78和pGPU6-shTBKl-983后，鸡TBK1的mRNA表达水平显著下降。[0071]图4⑻是将鸡TBK1基因与pGro6-shTBKl-78、pGPU6-shTBIQ-983、shNC分别共转染，检测鸡TBK1的mRNA表达水平，从图中可以看出，与shNC+TBK1对照相比，共转染后，鸡TBK1的mRNA表达量仍然显示出抑制，说明pGPU6-shTBKl-78、pGPU6-shTBKl-983的TBK1抑制效果显著。[0072]本发明提供了一种靶向鸡TANK结合激酶1CTBK1的小干扰RNA真核表达质粒的构建及用途。本发明利用RNA干扰技术，针对鸡TBK1基因的序列和载体的黏性末端，设计合成针对TBK1的DNA序列，构建小干扰RNA表达质粒pGPU6-shTBKl-78和pGPU6-shTBKl-983，并将该转染质粒pGPU6-shTBKl_78和pGPU6_shTBKl-983转染到DF1细胞中，在细胞水平上证实该干扰质粒能特异性抑制鸡TBK1基因的表达，为深入研究TBK1在鸡抗病毒先天免疫中的作用提供了平台。[0073]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

权利要求：1.一种鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：51、设计针对鸡TBK1的两条干扰RNA靶序列；52、根据步骤S1设计的两条干扰RNA靶序列，分别合成用于构建shRNA片段的两组互补的单链DNA序列，并分别在所述两组互补的单链DNA序列中引入相应的酶切位点；53、将所述两组互补的单链DNA序列分别经变性退火后，分别形成带有黏末端的双链DNA片段;然后，分别将所述双链DNA片段与载体连接，得到所述鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒。2.根据权利要求1所述的鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒的构建方法，其特征在于，步骤31中，所述两条干扰靶序列分别如3£〇10从.1和3£〇10从.2所示：SEQIDN0.1：GGACAAGGAGCTACTGCAAAT；SEQIDN0.2：GCAGATGACCTTGCACAAAGT〇3.根据权利要求1或2所述的鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒的构建方法，其特征在于，步骤S2中，当干扰靶序列如SEQIDN0.1所示时，所述互补的单链DNA序列为：正义链：GGACAAGGAGCTACTGCAAATttcaagagaATTTGCAGTAGCTCCTTGTCCTTTTTTG，如SEQIDNO.3所示，反义链:CCAAAAAAGGACAAGGAGCTACTGCAAATtctcttgaaATTTGCAGTAGCTCCTTGTCC，如SEQIDNO.4所示；当干扰靶序列如SEQIDNO.2所示时，所述互补的单链DNA序列为：正义链：GCAGATGACCTTGCACAAAGTttcaagagaACTTTGTGCAAGGTCATCTGC，如SEQIDNO.5所示，反义链：CCAAAAAAGCAGATGACCTTGCACAAAGTtctcttgaaACTTTGTGCAAGGTCATCTGC，如SEQIDNO.6所示。4.根据权利要求1所述的鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒的构建方法，其特征在于，步骤S3中，所述退火的程序为：9TC4min，7TC10min，5rCl5min，37t：20min，lrC10min。5.根据权利要求1所述的鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒的构建方法，其特征在于，步骤S3中，所述载体为pGPU6_Neo质粒。6.—种根据权利要求1所述的构建方法得到的鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒。7.—种根据权利要求6所述的鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒在制备TBK1信号转导通路的禽病毒性疾病的细胞模型中的应用;所述禽病毒性疾病包括禽流感病毒、新城疫病毒、禽白血病病毒中的至少一种。8.—种根据权利要求6所述的鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒转染细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤:利用脂质体将所述鸡TBK1基因的小干扰RNA质粒转染细胞。

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