买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：杭州师范大学

摘要：本发明公开了基于叶绿体基因组序列开发的苦蘵cpSSR标记引物及其应用。该引物对SEQIDNO.1～SEQIDNO.60是基于苦蘵叶绿体基因组序列开发获得的，在叶绿体基因组测序的基础上，对大量序列信息进行分析，进而开展cpSSR位点筛选和cpSSR标记引物设计。本专利克服了传统SSR标记开发效率低、周期长、费用高的问题，同时填补了苦蘵目前cpSSR标记信息的空白。通过cpSSR引物的筛选与遗传多样性分析，评价了cpSSR标记引物的多态性和适用性。本专利提供的cpSSR多态性标记引物为苦蘵的遗传多样性评价、种质鉴定、重要性状基因定位及分子标记辅助育种等研究奠定了基础。

主权项：1.基于叶绿体基因组序列开发的苦蘵cpSSR标记引物，其特征在于由30对多态性引物构成，其引物核苷酸序列信息如下：cpSSR2正向引物如SEQIDNO.1所示；cpSSR2反向引物如SEQIDNO.2所示；cpSSR4正向引物如SEQIDNO.3所示；cpSSR4反向引物如SEQIDNO.4所示；cpSSR17正向引物如SEQIDNO.5所示；cpSSR17反向引物如SEQIDNO.6所示；cpSSR18正向引物如SEQIDNO.7所示；cpSSR18反向引物如SEQIDNO.8所示；cpSSR19正向引物如SEQIDNO.9所示；cpSSR19反向引物如SEQIDNO.10所示；cpSSR21正向引物如SEQIDNO.11所示；cpSSR21反向引物如SEQIDNO.12所示；cpSSR23正向引物如SEQIDNO.13所示；cpSSR23反向引物如SEQIDNO.14所示；cpSSR24正向引物如SEQIDNO.15所示；cpSSR24反向引物如SEQIDNO.16所示；cpSSR25正向引物如SEQIDNO.17所示；cpSSR25反向引物如SEQIDNO.18所示；cpSSR26正向引物如SEQIDNO.19所示；cpSSR26反向引物如SEQIDNO.20所示；cpSSR29正向引物如SEQIDNO.21所示；cpSSR29反向引物如SEQIDNO.22所示；cpSSR30正向引物如SEQIDNO.23所示；cpSSR30反向引物如SEQIDNO.24所示；cpSSR31正向引物如SEQIDNO.25所示；cpSSR31反向引物如SEQIDNO.26所示；cpSSR34正向引物如SEQIDNO.27所示；cpSSR34反向引物如SEQIDNO.28所示；cpSSR35正向引物如SEQIDNO.29所示；cpSSR35反向引物如SEQIDNO.30所示；cpSSR36正向引物如SEQIDNO.31所示；cpSSR36反向引物如SEQIDNO.32所示；cpSSR37正向引物如SEQIDNO.33所示；cpSSR37反向引物如SEQIDNO.34所示；cpSSR38正向引物如SEQIDNO.35所示；cpSSR38反向引物如SEQIDNO.36所示；cpSSR39正向引物如SEQIDNO.37所示；cpSSR39反向引物如SEQIDNO.38所示；cpSSR41正向引物如SEQIDNO.39所示；cpSSR41反向引物如SEQIDNO.40所示；cpSSR42正向引物如SEQIDNO.41所示；cpSSR42反向引物如SEQIDNO.42所示；cpSSR44正向引物如SEQIDNO.43所示；cpSSR44反向引物如SEQIDNO.44所示；cpSSR45正向引物如SEQIDNO.45所示；cpSSR45反向引物如SEQIDNO.46所示；cpSSR46正向引物如SEQIDNO.47所示；cpSSR46反向引物如SEQIDNO.48所示；cpSSR47正向引物如SEQIDNO.49所示；cpSSR47反向引物如SEQIDNO.50所示；cpSSR48正向引物如SEQIDNO.51所示；cpSSR48反向引物如SEQIDNO.52所示；cpSSR49正向引物如SEQIDNO.53所示；cpSSR49反向引物如SEQIDNO.54所示；cpSSR50正向引物如SEQIDNO.55所示；cpSSR50反向引物如SEQIDNO.56所示；cpSSR51正向引物如SEQIDNO.57所示；cpSSR51反向引物如SEQIDNO.58所示；cpSSR53正向引物如SEQIDNO.59所示；cpSSR53反向引物如SEQIDNO.60所示。

全文数据：基于叶绿体基因组序列开发的苦蘵cpSSR标记引物及其应用技术领域本发明属于植物生物技术领域，具体涉及基于叶绿体基因组序列开发的苦蘵cpSSR标记引物及其应用。背景技术苦蘵PhysalisangulataL.，为茄科Solanaceae酸浆属Physalis一年生草本植物，别名炮仔灯、灯笼草、天泡子、天泡草、小酸浆、朴朴草等，分布于世界热带与亚热带地区，常生于海拔500～1500米。在我国主要分布于华东、华中、华南及西南等地。作为传统中药材，蘵以果、根或全草入药，具有清热解毒，利咽化痰，利尿通淋之功效，用于治疗肝炎、哮喘、疟疾、风湿、癌症等疾病。现代医学研究发现苦蘵中的酸浆苦素类Physalin和睡茄内酯类Physagulin化合物具有很强的醌还原酶诱导、抗炎、免疫调节或抗肿瘤活性。另外，苦蘵果实中的多糖对超氧阴离子自由基和二苯代苦味自由基起抗氧化作用，苦蘵提取液具有抗菌消炎、降血糖、降血脂等疗效。此外，苦蘵果实还被誉为高档的“本草水果”，可以做罐头、蜜饯和沙拉酱汁，不但风味独特，而且具有提高人体肌体免疫力、美容养颜、预防心脑血管病、延缓衰老等效果。由此可见，苦蘵是新型“药食两用”植物资源，具有很高的研究价值和广阔的开发前景。微卫星分子标记Microsatellitemarker是根据简单重复序列simplesequencerepeats,SSRs开发的分子标记，根据简单重复序列两侧的保守序列设计引物，通过检测重复数目的差异反映等位基因间的多态性，该标记类型广泛分布于真核生物的核基因组和细胞器基因组中的不同位置。目前，SSR分子标记被认为是最理想的分子标记之一，在生物的种质鉴定、遗传多样性评价和亲缘关系分析研究中已经有了广泛应用。高等植物叶绿体微卫星chloroplastmicrosatellite,cpSSR是SSR标记的一种，广泛分布于植物叶绿体基因组中，是以单核苷酸A或T为主要重复单元组成的多核苷酸重复串联序列。cpSSR不但具有和基因组SSR标记的共显性、多态性高、等位点多等优点，同时还具备叶绿体基因组的进化速度慢、分子量小、相对保守、结构简单和单亲遗传等特点。迄今为止，尚未有关于苦蘵cpSSR标记开发及应用的研究报道。本发明以通过高通量测序技术获得的苦蘵叶绿体基因组序列信息，开发获得一批苦蘵cpSSR标记引物，将为苦蘵的遗传多样性分析、种质资源鉴定、重要性状基因定位及分子标记辅助育种等研究起到重要的推动作用。发明内容本发明的目的是针对目前缺乏苦蘵cpSSR标记引物的不足，提取基于叶绿体基因组序列开发的苦蘵cpSSR标记引物及其应用。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：基于叶绿体基因组序列开发获得苦蘵多态性cpSSR标记引物，包括30对引物，其引物核苷酸序列如下所示：cpSSR2正向引物如序列表中SEQIDNO.1所示；cpSSR2反向引物如序列表中SEQIDNO.2所示；cpSSR4正向引物如序列表中SEQIDNO.3所示；cpSSR4反向引物如序列表中SEQIDNO.4所示；cpSSR17正向引物如序列表中SEQIDNO.5所示；cpSSR17反向引物如序列表中SEQIDNO.6所示；cpSSR18正向引物如序列表中SEQIDNO.7所示；cpSSR18反向引物如序列表中SEQIDNO.8所示；cpSSR19正向引物如序列表中SEQIDNO.9所示；cpSSR19反向引物如序列表中SEQIDNO.10所示；cpSSR21正向引物如序列表中SEQIDNO.11所示；cpSSR21反向引物如序列表中SEQIDNO.12所示；cpSSR23正向引物如序列表中SEQIDNO.13所示；cpSSR23反向引物如序列表中SEQIDNO.14所示；cpSSR24正向引物如序列表中SEQIDNO.15所示；cpSSR24反向引物如序列表中SEQIDNO.16所示；cpSSR25正向引物如序列表中SEQIDNO.17所示；cpSSR25反向引物如序列表中SEQIDNO.18所示；cpSSR26正向引物如序列表中SEQIDNO.19所示；cpSSR26反向引物如序列表中SEQIDNO.20所示；cpSSR29正向引物如序列表中SEQIDNO.21所示；cpSSR29反向引物如序列表中SEQIDNO.22所示；cpSSR30正向引物如序列表中SEQIDNO.23所示；cpSSR30反向引物如序列表中SEQIDNO.24所示；cpSSR31正向引物如序列表中SEQIDNO.25所示；cpSSR31反向引物如序列表中SEQIDNO.26所示；cpSSR34正向引物如序列表中SEQIDNO.27所示；cpSSR34反向引物如序列表中SEQIDNO.28所示；cpSSR35正向引物如序列表中SEQIDNO.29所示；cpSSR35反向引物如序列表中SEQIDNO.30所示；cpSSR36正向引物如序列表中SEQIDNO.31所示；cpSSR36反向引物如序列表中SEQIDNO.32所示；cpSSR37正向引物如序列表中SEQIDNO.33所示；cpSSR37反向引物如序列表中SEQIDNO.34所示；cpSSR38正向引物如序列表中SEQIDNO.35所示；cpSSR38反向引物如序列表中SEQIDNO.36所示；cpSSR39正向引物如序列表中SEQIDNO.37所示；cpSSR39反向引物如序列表中SEQIDNO.38所示；cpSSR41正向引物如序列表中SEQIDNO.39所示；cpSSR41反向引物如序列表中SEQIDNO.40所示；cpSSR42正向引物如序列表中SEQIDNO.41所示；cpSSR42反向引物如序列表中SEQIDNO.42所示；cpSSR44正向引物如序列表中SEQIDNO.43所示；cpSSR44反向引物如序列表中SEQIDNO.44所示；cpSSR45正向引物如序列表中SEQIDNO.45所示；cpSSR45反向引物如序列表中SEQIDNO.46所示；cpSSR46正向引物如序列表中SEQIDNO.47所示；cpSSR46反向引物如序列表中SEQIDNO.48所示；cpSSR47正向引物如序列表中SEQIDNO.49所示；cpSSR47反向引物如序列表中SEQIDNO.50所示；cpSSR48正向引物如序列表中SEQIDNO.51所示；cpSSR48反向引物如序列表中SEQIDNO.52所示；cpSSR49正向引物如序列表中SEQIDNO.53所示；cpSSR49反向引物如序列表中SEQIDNO.54所示；cpSSR50正向引物如序列表中SEQIDNO.55所示；cpSSR50反向引物如序列表中SEQIDNO.56所示；cpSSR51正向引物如序列表中SEQIDNO.57所示；cpSSR51反向引物如序列表中SEQIDNO.58所示；cpSSR53正向引物如序列表中SEQIDNO.59所示；cpSSR53反向引物如序列表中SEQIDNO.60所示；上述cpSSR引物对是通过高通量测序技术获得的苦蘵叶绿体基因组序列信息进而获得的，具体包括以下步骤：1叶绿体基因组序列的获得剪取100mg的苦蘵活体样品新鲜叶片，利用液氮快速研磨至粉末状，将粉末快速转移至1.5mL离心管中，采取CTAB方法进行基因组总DNA提取。利用1.0％的琼脂糖凝胶对样品总DNA进行完整性电泳检测，并利用紫外分光光度计进行浓度检测。采取长PCR扩增Long-rangePCRamplification技术对提取的样品总DNA进行扩增。将扩增产物混合至总DNA浓度为～6μgL。利用物理方法打断DNA片段，依据Illumina的技术指南，构建Illumina测序文库，建库片段大小为500bp。然后在IlluminaMiseq测序平台进行上样测序，测序策略为两端测序Paired-endsequencing，测序长度为250bp。利用NGSQCToolkitv2.3.3软件www.nipgr.res.inngsqctoolkit.html对测序原始数据进行质量过滤，过滤掉测序质量较低的序列PHREDqualityscore杭州师范大学基于叶绿体基因组序列开发的苦蘵cpSSR标记引物及其应用160SIPOSequenceListing1.0122DNA人工序列Unknown1cgtagaaagacgaaagtggatt22222DNA人工序列Unknown2aaactcttcgctattgggtaaa22325DNA人工序列Unknown3atagataaatacaccaaacaacaaa25425DNA人工序列Unknown4gatagaagttaatcagtaatgggaa25523DNA人工序列Unknown5tcaacaatgatccactagacact23623DNA人工序列Unknown6ttttcccctcaaatatgaatact23720DNA人工序列Unknown7aggttctttaaattccgtgg20820DNA人工序列Unknown8tcctttttcaaatcctgctg20922DNA人工序列Unknown9tgatcgtgaccttgaacctgtt221022DNA人工序列Unknown10tccctctctctccttttttgct221123DNA人工序列Unknown11tttttcctattttgacttctatg231223DNA人工序列Unknown12atctgtcattacgtgcgactatc231323DNA人工序列Unknown13acaaggaatgaaaagaaaaaaga231423DNA人工序列Unknown14aataatagatagtaaatgggtcg231524DNA人工序列Unknown15gggatgaattggataaatatacag241624DNA人工序列Unknown16tagatgattgataatgttcctttg241722DNA人工序列Unknown17gaataaaaaaaagaatagggaa221821DNA人工序列Unknown18tagaattgtgataaatcgaaa211924DNA人工序列Unknown19ttctcctgtttctcttgttttttt242024DNA人工序列Unknown20ctcttctatttgattacttgttct242121DNA人工序列Unknown21ctttgcgtttttctttctttt212221DNA人工序列Unknown22acccaatttttattttttacc212324DNA人工序列Unknown23gagtttttgactttcattattttg242420DNA人工序列Unknown24ttttcttccccgcatttatc202522DNA人工序列Unknown25aaaagaaaaagaaatccatttt222622DNA人工序列Unknown26gttgggttcatccctgtagtaa222722DNA人工序列Unknown27ctctacaagaaaattgaccccc222822DNA人工序列Unknown28tgctgaatcacagacaaaaaaa222922DNA人工序列Unknown29gataaagtcggttgattagggt223022DNA人工序列Unknown30attgaaaaatcgaagaaaagcc223121DNA人工序列Unknown31cccattaccatttctttttgt213221DNA人工序列Unknown32tgaagtatccaggctccgttt213323DNA人工序列Unknown33tttgttttgtaatggatagttgc233423DNA人工序列Unknown34tttttgttattgggataggtgaa233524DNA人工序列Unknown35tctttgttttgtaatggatagttg243624DNA人工序列Unknown36gtttttttgttattgggataggtg243721DNA人工序列Unknown37ttggctgttattcaaaaggtc213821DNA人工序列Unknown38acaatcaacatacggttcctt213923DNA人工序列Unknown39ttcttatttaatggttaggtccg234023DNA人工序列Unknown40aaagcatcaatacgcattcatac234123DNA人工序列Unknown41attgtgggtataatggtagatgc234223DNA人工序列Unknown42tggaagaagaagtagaaaaagga234321DNA人工序列Unknown43aaaatggaaagttcgacacaa214421DNA人工序列Unknown44gaagagaagcaaatgaaaggc214521DNA人工序列Unknown45gtgacgatactgtaggggagg214621DNA人工序列Unknown46atttcgggttaagaagatgtg214723DNA人工序列Unknown47aggtcgtgtcatctttcttccat234823DNA人工序列Unknown48cacaaaacccctttctactcaat234922DNA人工序列Unknown49ggaaagaaacaaaaaaaagaaa225022DNA人工序列Unknown50tgagaaaggagaataggaatga225124DNA人工序列Unknown51caattttcagattcagtttgacta245224DNA人工序列Unknown52aagaaaccaaagaatggcttatca245320DNA人工序列Unknown53gccattctttggtttctttt205420DNA人工序列Unknown54tccttttttgagcccatttt205521DNA人工序列Unknown55atcaatgaaggtaatagaata215621DNA人工序列Unknown56caaacaaaaagagaagagaaa215721DNA人工序列Unknown57cgaggtgtgaagtgggagaga215821DNA人工序列Unknown58cgacgccaggatgataaaaag215924DNA人工序列Unknown59gtaatttcatagagtcattcggtc246024DNA人工序列Unknown60ccaaactgtacaagcttcttccaa24

权利要求：1.基于叶绿体基因组序列开发的苦蘵cpSSR标记引物，其特征在于由30对多态性引物构成，其引物核苷酸序列信息如下：cpSSR2正向引物如SEQIDNO.1所示；cpSSR2反向引物如SEQIDNO.2所示；cpSSR4正向引物如SEQIDNO.3所示；cpSSR4反向引物如SEQIDNO.4所示；cpSSR17正向引物如SEQIDNO.5所示；cpSSR17反向引物如SEQIDNO.6所示；cpSSR18正向引物如SEQIDNO.7所示；cpSSR18反向引物如SEQIDNO.8所示；cpSSR19正向引物如SEQIDNO.9所示；cpSSR19反向引物如SEQIDNO.10所示；cpSSR21正向引物如SEQIDNO.11所示；cpSSR21反向引物如SEQIDNO.12所示；cpSSR23正向引物如SEQIDNO.13所示；cpSSR23反向引物如SEQIDNO.14所示；cpSSR24正向引物如SEQIDNO.15所示；cpSSR24反向引物如SEQIDNO.16所示；cpSSR25正向引物如SEQIDNO.17所示；cpSSR25反向引物如SEQIDNO.18所示；cpSSR26正向引物如SEQIDNO.19所示；cpSSR26反向引物如SEQIDNO.20所示；cpSSR29正向引物如SEQIDNO.21所示；cpSSR29反向引物如SEQIDNO.22所示；cpSSR30正向引物如SEQIDNO.23所示；cpSSR30反向引物如SEQIDNO.24所示；cpSSR31正向引物如SEQIDNO.25所示；cpSSR31反向引物如SEQIDNO.26所示；cpSSR34正向引物如SEQIDNO.27所示；cpSSR34反向引物如SEQIDNO.28所示；cpSSR35正向引物如SEQIDNO.29所示；cpSSR35反向引物如SEQIDNO.30所示；cpSSR36正向引物如SEQIDNO.31所示；cpSSR36反向引物如SEQIDNO.32所示；cpSSR37正向引物如SEQIDNO.33所示；cpSSR37反向引物如SEQIDNO.34所示；cpSSR38正向引物如SEQIDNO.35所示；cpSSR38反向引物如SEQIDNO.36所示；cpSSR39正向引物如SEQIDNO.37所示；cpSSR39反向引物如SEQIDNO.38所示；cpSSR41正向引物如SEQIDNO.39所示；cpSSR41反向引物如SEQIDNO.40所示；cpSSR42正向引物如SEQIDNO.41所示；cpSSR42反向引物如SEQIDNO.42所示；cpSSR44正向引物如SEQIDNO.43所示；cpSSR44反向引物如SEQIDNO.44所示；cpSSR45正向引物如SEQIDNO.45所示；cpSSR45反向引物如SEQIDNO.46所示；cpSSR46正向引物如SEQIDNO.47所示；cpSSR46反向引物如SEQIDNO.48所示；cpSSR47正向引物如SEQIDNO.49所示；cpSSR47反向引物如SEQIDNO.50所示；cpSSR48正向引物如SEQIDNO.51所示；cpSSR48反向引物如SEQIDNO.52所示；cpSSR49正向引物如SEQIDNO.53所示；cpSSR49反向引物如SEQIDNO.54所示；cpSSR50正向引物如SEQIDNO.55所示；cpSSR50反向引物如SEQIDNO.56所示；cpSSR51正向引物如SEQIDNO.57所示；cpSSR51反向引物如SEQIDNO.58所示；cpSSR53正向引物如SEQIDNO.59所示；cpSSR53反向引物如SEQIDNO.60所示。2.根据权利要求1所述的苦蘵cpSSR标记引物，其特征在于，所述引物通过以下步骤获得：1通过高通量测序技术获取苦蘵叶绿体基因组序列；2cpSSR位点鉴别及cpSSR引物设计；步骤1具体为：采取长PCR扩增Long-rangePCRamplification技术对利用CTAB方法提取的苦蘵样品基因组总DNA进行扩增；将扩增产物混合至总DNA浓度为～6μgL；利用物理方法打断DNA片段，构建Illumina测序文库，建库片段大小为500bp；然后在IlluminaMiseq测序平台进行上样测序，测序策略为两端测序Paired-endsequencing，测序长度为250bp；然后，对测序获得原始数据进行质量过滤；最后，经过从头拼接、序列比对及组装，获得完整的苦蘵叶绿体基因组序列。3.根据权利要求2所述的获取苦蘵cpSSR标记引物的方法，其特征在于，所述步骤2具体为：①利用MISAperl脚本软件搜索苦蘵叶绿体基因组中分布的SSR位点，参数设定分别为：单核苷酸重复序列，重复单元≥10；二核苷酸重复序列，重复单元≥5；三核苷酸重复序列，重复单元≥4；四、五、六核苷酸重复序列，重复单元≥3；②利用PrimerPremier5软件进行cpSSR引物设计，同时结合人工手动调整；引物设计参数原则：引物长度为18～26个碱基，退火温度为50℃～60℃，扩增产物大小集中在100～300bp。4.如权利要求1或2或3所述的苦蘵cpSSR标记引物在苦蘵及近缘种种质资源遗传多样性、品种鉴定及亲缘关系研究上的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于遗传多样性分析具体应用包括如下：步骤一、基因组DNA提取采取CTAB方法对苦蘵种质资源的基因组DNA进行提取；步骤二、cpSSR-PCR反应cpSSR-PCR体系：总反应体积为10μL，具体包括1μL的10×Buffer[200mMTris–HClpH8.8，100mMKCl，100mMNH42SO4，20mMMgCl2，1％TritonX-100]，0.8μL的dNTPs10mmolL，cpSSR引物上、下游引物各1μL，0.5μL的Taq酶2UμL,1μL模板DNA50ngμL，4.7μL的ddH2O；扩增产物在EppendorfAG22331Hamburg型PCR扩增仪上进行PCR扩增反应；cpSSR-PCR程序为：94℃预变性5min；32个循环94℃变性50min；不同cpSSR引物Tm值复性50s；72℃延伸1.5min；最后72℃延伸10min；步骤三、电泳检测采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳PAGE对步骤二获得PCR产物进行电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳1.5～2.0小时；步骤四、数据分析利用Quantityone软件及人工辅助判读的方法进行电泳图拷带；为了保证结果的准确性，每对引物需进行二次重复PCR扩增和电泳检测，并只统计清晰度高、稳定性好的电泳位点；同一位点有条带记作“l”，无条带记作“0”；利用NTSYS-pc2.10e软件构建种群间的非加权组算术平均数法聚类图。

百度查询： 杭州师范大学 基于叶绿体基因组序列开发的苦蘵cpSSR标记引物及其应用