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申请/专利权人：华中农业大学

摘要：本发明提供了一种简便有效的植物长片段insituDLOHi‑C测序文库的构建方法，属于植物三维基因组技术领域，将植物组织交联，浆状，过滤，将滤液与SDS混合，水浴，与TritonX‑100混合，离心，将细胞核与体系混合，酶切，将酶切物与linker连接，离心，重悬细胞核于体系，水浴后与连接体系混合临近连接，离心，将细胞核与解交联体系混合，解交联，纯化，将DNA与预处理后的链霉亲和素磁珠孵育，将磁珠与Tn5转座酶体系混合酶切加接头，洗去背景，扩增，富集DNA片段，得到测序文库。采用本发明提供的方法在以玉米为测试对象时，产生的高通量数据在数据信噪比和染色质交互鉴定上具有较强的优势。

主权项：1.一种简便有效的植物长片段insituDLOHi-C测序文库的构建方法，其特征在于，由以下步骤构成：1将植物组织浸入含质量体积百分浓度1％甲醛的PBS交联缓冲液中交联10～20min，加甘氨酸终止交联、润洗，得到交联植物组织；2将所述步骤1得到的交联植物组织浸入PP缓冲液中，经刀片将交联植物组织至浆状，过滤，得到滤液，所述滤液中细胞核的数量为50～250万个；3将所述步骤2得到的滤液与十二烷基硫酸钠混合，得到第一混合物，将所述第一混合物在60～70℃下水浴4～6min后，与TritonX-100混合，得到第二混合物，将所述第二混合物在35～42℃下水浴8～12min，得到第一水浴物；4将所述步骤3得到的第一水浴物离心，得到细胞核，将所述细胞核与含限制性内切酶MseI的体系混合，在37℃下酶切6～12h，得到酶切物；所述含限制性内切酶MseI的体系组分为310μlddH2O、20μl体积百分浓度为20％的TritonX-100溶液、40μl10×NEBuffer2和酶活为10unitsμl的30μl限制性内切酶MseI；5将所述步骤4得到的酶切物与带生物素标记的linker连接体系混合后，在20～25℃下连接50～70min，得到linker连接物；所述linker的制备方法包括：将前义链和后义链杂交后，得到linker，所述前义链的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述后义链的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；6将所述步骤5得到的linker连接物离心、润洗，得到细胞核，将所述细胞核与linker末端磷酸化体系混合后，在37℃下水浴25～35min，得到第二水浴物；所述linker末端磷酸化体系组分为170μlddH2O、20μl10×T4ligasebuffer、10μl酶活为10unitμl的T4多聚核苷酸激酶和5μl体积百分浓度为20％的TritonX-100溶液；7将所述步骤6第二水浴物与连接体系混合后，在20～25℃下，使细胞核内的染色质临近连接1.5～3h，得到临近连接物；所述连接体系为：230μlddH2O、30μl10×T4ligasebuffer、40μl酶活为5unitsμl的T4DNAligase和TritonX-100，所述连接体系中TritonX-100体积百分浓度为0.5％；8将所述步骤7得到的临近连接物离心，得到细胞核，将所述细胞核与解交联体系混合，在60～70℃下解交联2～6h后，纯化DNA，得到DNA；所述解交联体系为：440μlddH2O、10μl20mgml蛋白酶K、25μl质量体积百分浓度为20％的十二烷基硫酸钠溶液和25μl5MNaCl溶液；9对链霉亲和素磁珠进行封闭，用2×bindingbuffer润洗磁珠2遍后，用I-blockbuffer重悬磁珠，室温旋转孵育45min～1.5h，磁珠再用1×bindingbuffer润洗2次，重悬在包含鱼精DNA的1×bindingbuffer中，25～30℃孵育30min～60min，磁珠再用1×bindingbuffer润洗2次，重悬于1×bindingbuffer中，得到预处理的链霉亲和素磁珠；10将所述步骤8得到的DNA与所述步骤9得到的预处理的链霉亲和素磁珠混合，在20～30℃下孵育1～2h，收集磁珠；11将所述步骤10得到的磁珠用1×bindingbuffer润洗2遍后，与Tn5转座酶体系混合，在55℃下进行酶切15～25min后，收集磁珠；12将所述步骤11得到的磁珠用washbuffer在1000rpm、55℃、5min条件下清洗4～7次，同样条件下用1xbindingbuffer和Elutionbuffer各清洗一次，得到去除背景后的磁珠；13用PCR体系重悬所述步骤12得到的磁珠后，进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物经DNAcleanbeads筛选后，溶于ddH2O中，得到DNA长度300～600个碱基对的植物长片段insituDLOHi-C测序文库；所述步骤1植物组织包括玉米组织。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 华中农业大学 一种简便有效的植物长片段in situ DLO Hi-C测序文库的构建方法