买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：中国农业科学院生物技术研究所

摘要：本发明公开了一个水稻ERF家族成员OsERF2调控水稻籽粒大小和千粒重的方法，包括OsOsERF2基因表达沉默与过量表达载体的构建步骤与转基因植株的获得步骤。本发明所述OsERF2过表达或基因沉默影响水稻籽粒大小与千粒重。通过转基因技术创建所述OsERF2基因沉默和基因过表达的转基因水稻，获得的转基因植株具有能影响籽粒大小，因而，该基因是水稻粒型性状的一个新调控因子，在提高水稻种子大小和产量上具有重要应用价值和经济效益。

主权项：1.一种培育籽粒遗传改良水稻品种的方法，其特征在于，通过基因工程方法将水稻中的OsERF2基因进行沉默或基因过表达，以获得籽粒大小改良的植株；所述OsERF2基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

全文数据：OsERF2基因调控水稻籽粒大小的应用技术领域本发明属于生物技术领域，涉及一种调控水稻对籽粒大小的基因及其在水稻产量遗传改良中的应用。背景技术水稻经过长期的自然选择和人工驯化，形成了适应不同地域栽培的优良品种。栽培稻主要分为粳稻与籼稻两个亚种，在粒型、穗型、株型等方面有很大差异。典型的籼稻籽粒为长粒型，典型的粳稻籽粒为短、圆型。水稻粒形性状主要包括粒长、粒宽、粒厚、粒重和长宽比等，是构成水稻产量和外观品质的重要指标，对提高产量、精米商品价值和市场竞争力具有重要作用,因此，水稻籽粒的大小是影响产量和品质的重要因素。籽粒形状和千粒重是受多基因控制的数量性状，在不同种质资源中存在的不同等位基因是造成表型差异的内在原因。经过多年的努力，科学家成功克隆和鉴定了多个控制水稻粒长与千粒重的关键基因，并深入研究了其分子机理及在水稻遗传改良中的作用。如GLW7编码转录因子OsSPL13，通过增加细胞大小而使籽粒变大，同时还能增加穗长、一级枝梗和二级枝梗数目以及每穗粒数，最终增加水稻产量。GS5编码一个丝氨酸羧肽酶，正向调控水稻籽粒大小。水稻BIGGRAIN1基因通过调控生长素的极性运输调节籽粒大小，该基因过表达植株的籽粒变大、千粒重增加；GS3基因控制水稻籽粒大小，几乎所有的优良粳稻品种都带有完整的GS3蛋白，表现为中等粒型，优良长粒型籼稻品种的GS3蛋白无功能，通过对该基因的导入和替换，能有效地改变水稻品种的粒型，表明GS3对水稻的产量和品质有重要的决定作用，是粒型的变异和演化的主要决定因子之一；水稻细胞色素P450基因OsCYP78A13过表达使籽粒显著变大；GW2编码一个环型E3泛素连接酶，负调节细胞的分裂，激活颖花外壳细胞的分裂，从而增加颖花外壳的宽度，提高灌浆速率，胚乳的大小增加，最终增加谷壳的宽度、粒重以及产量;GW8基因的等位变异，使籽粒变为细长型，可明显提高稻米品质，但导致水稻产量损失14%。乙烯应答因子（ERF）含有一个保守的ERF结构域的转录因子，水稻中有170多个ERF基因，调控抗逆和生长发育等过程。水稻OsDREB1A、OsDREB1G和OsDREB2B超表达能提高转基因水稻对非生物胁迫的耐性。OsERF71、OsERF3、CRL5和shb等ERF成员调控水稻根系形态的建成。我们最近研究发现OsERF2基因过表达负调控水稻籽粒大小与千粒重，而该基因沉默能调高水稻籽粒大小与千粒重。因此，通过生物技术利用OsERF2培育籽粒大小与千粒重改良的水稻材料具有重要的现实意义。发明内容本发明人创建水稻OsERF2基因沉默或过表达的转基因水稻，农艺性状表型分析发现OsERF2基因沉默能提高水稻籽粒大小与千粒重，而该基因过表达则降低水稻籽粒大小与千粒重，表明OsERF2能调控水稻籽粒大小的功能，可以通过转基因的遗传改良技术提高水稻的产量。本发明提供的技术方案是：一种培育籽粒遗传改良水稻品种的方法，通过基因工程方法将植物中的OsERF2基因进行沉默或基因过表达，以获得籽粒大小改良的植株。所述的方法，所述OsERF2基因是其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其编码氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。上述的方法，所述植物为水稻。上述的方法，所述转基因水稻为籽粒大小提高或降低。上述的方法，所述基因工程方法是RNAi干扰方法使基因沉默，使转基因水稻的籽粒大小提高；或通过转基因方法，基因过表达，使转基因水稻的籽粒大小降低。同时，本发明还提供一种OsERF2基因在制备籽粒大小改良的植株中的应用；所述OsERF2基因是其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。上述的应用，其是通过RNAi干扰方法使基因沉默，使转基因水稻的籽粒大小提高，或者通过转基因方法获得，基因过表达，使转基因水稻的籽粒大小降低。本发明具有以下有益效果：本发明研究意外发现OsERF2在水稻籽粒大小形成中发挥重要的作用。通过转基因技术创建OsERF2基因沉默与基因过表达的转基因水稻，转基因植株的籽粒大小与千粒重发生改变，进而培育籽粒大小与千粒重增加的转基因植物品种。实验表明，通过人工小RNA方法artificialmicroRNA将本发明所述的编码OsERF2的DNA序列片段导入水稻中使OsERF2基因的沉默过表达部分抑制（通过RNAi方法抑制水稻OsERF2的表达），能够提高转基因水稻的籽粒大小和千粒重，而该基因的过表达在负调控水稻的籽粒大小与千粒重。表明通过基因沉默的转基因技术，利用OsERF2基因可以对水稻种子的粒型与产量进行遗传改良，附图说明图1OsERF2基因沉默（Ri1、Ri2）和基因过表达（OE1、OE2）转基因水稻中OsERF2基因表达水平分别降低和升高。图2OsERF2基因沉默的转基因水稻（AmiERF-1、AmiERF2-2）的种子籽粒变大，而基因过表达的转基因水稻ERF2-OE1、ERF2-OE2种子籽粒变小。图3OsERF2基因沉默水稻（AmiERF-1、AmiERF2-2）和基因过表达ERF2-OE1、ERF2-OE2的种子千粒重比较：OsERF2基因沉默的转基因水稻的千粒重提高，而基因过表达的转基因水稻种子的千粒重降低。图4OsERF2基因沉默（R1、R2）和过表达水稻OE1、OE2中OsPHYB的表达水平分析。图5OsERF2基因沉默载体pCAMBIA5300-AmiERF2（A）和基因过表达载体pCAMBIA5300-AmiERF2）（B）的构建示意图。具体实施方式下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。实施例一转基因水稻材料的创建本发明人通过农杆菌侵染法创建OsERF2基因沉默和过表达的转基因水稻。基因沉默方法如下：利用其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示基因（OsERF2基因）3’端非编码区序列AGCATCATTTAGAGCATAA作为目的序列，通过生物信息学分析设计约21碱基amiRNA；以内源miRNA前体（pre-miRNA）骨架为模板，采用重叠PCR构建amiRNA基因；将amiRNA基因克隆到相应的植物转化载体上；通过转基因技术将amiRNA导入植物体中，利用植物的miRNA加工作用体系表达amiRNA并沉默靶基因。构建过程如下：首先针对ERF2基因利用WMD3软件Designer模块http:wmd3.weigelworld.org设计amiRNA序列，以Oligo模块以pNW55为载体设计4条amiRNA重叠PCR引物，即PImiR-s1thagTTTATGCTCTAAATGATGCTGcaggagattcagtttga，PIImiR-a1thtgCAGCATCATTTAGAGCATAAActgctgctgctacagcc，PIIImiR*s1thctCAGCAACATATAGAGCATAAAttcctgctgctaggctg和PIVmiR*a1thaaTTTATGCTCTATATGTTGCTGagagaggcaaaagtgaa。结合通用引物G-43685’-CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3’和G-43695’-GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’以质粒pNW55克隆有水稻内源miRNA基因osa-MIR528的254bp的前体miRNA序列为模板，运用3对引物G-4368+PII，PI+PIV，PIII+G-4369进行PCR扩增。分别将PCR产物回收后混合作为模板，运用引物对G-4368+G-4369进行融合PCR获得554b的产物，运用BamHIKpnI双酶切后转入植物转化载体pCAMBIA5300，得到表达载体（pCAMBIA5300-AmiERF2）（图5A），导入根癌农杆菌AGL0中。基因过表达方法如下：利用其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示OsERF2基因的DNA序列作为目的序列，设计上下游引物（F5'-ggGGATCCATGGCTCGCCTCACCACACTGAT-3'，R5'-ggGGTACCCATCAGCAGGAGATCTCCATG-3'）进行PCR扩增，PCR产物BamHIKpnI双酶切后转入植物转化载体pCAMBIA5300，得到表达载体（pCAMBIA5300-ERF2）（图5B），导入根癌农杆菌AGL0中。农杆菌侵染法创建OsERF2基因沉默和基因过表达转基因水稻方法如下：1）水稻胚愈伤的诱导与继代：将水稻种子日本睛脱壳，用75%乙醇浸泡1min，用次氯酸钠溶液浸泡30min，无菌水冲洗，用次氯酸钠重复浸泡15min，用无菌水冲洗。将灭菌后的水稻种子于灭菌滤纸上晾干，种于诱导培养基中。28℃暗培养2周。分离愈伤组织转移至诱导培养基28℃继代3次。挑取颜色淡黄且质地松散愈伤颗粒28℃暗培养3天。2）菌种活化及扩繁：在28℃条件下，将含有目的基因表达载体（pCAMBIA5300-AmiERF2和pCAMBIA5300-ERF2）的农杆菌分别于YEB固体培养基上划线培养2天。3）农杆菌与愈伤组织的共培养：取适量菌体悬浮于100μMAS+AA液体培养基中，菌液OD值达0.3时，使愈伤组织浸入菌液中，轻摇20分钟。弃菌液，取出愈伤，滤干多余菌液，转移到NB固体培养基上22℃暗培养3天。4）筛选抗性愈伤：挑选共培养的愈伤组织，无菌水漂洗，滤干后铺于筛选培养基上，28℃暗培养2周后继代一次。5）预分化与分化：选生长旺盛呈乳白色的愈伤组织转至预分化培养基上，28℃暗培养1周，28℃光照培养2周，见到绿点时继代一次，4周后分化成苗。6）生根与壮苗：将长势较好的幼苗移至生根培养基上，培养2周后移栽。7）将生长正常的转基因苗移栽温室培养至种子的收获。8）得到的转基因阳性植株的幼苗，经加代获得T1和高世代的种子。实施例二基因沉默和过表达不同转基因材料中OsERF2和OsPHYB的表达水平鉴定TRIzol方法提取2周龄野生型、OsERF2基因沉默和过表达转基因植株叶片总RNA，取2μg总RNA，以2μRNase-freeDNase37℃处理30min，以polyA为引物，利用M-MLV反转录酶42℃合成cDNA为模板，以Ubiquitin引物5-CCATCCTCAAGCTGCTTACC-3和5-GACTGGCAAGACCATTACCC-3为内参，PCR方法检测OsERF2基因引物5-AGATCTCCTGCTGATGTGCC3和5-CACAAGCTGCTCCAGAACTC-3表达，OsERF2转基因水稻的检测结果如图1所示。相对于野生型对照植株，OsERF2表达在转基因植株Ri-1,Ri-2中减少为野生型的30%-50%。这表明在转基因植株中OsERF2的表达被部分沉默。基因过表达转基因水稻的检测结果如图2所示，相对于野生型对照植株，OsERF2的表达在过表达转基因植株OE-1,OE-2中提高到为野生型的2-3倍。这表明在转基因植株中OsERF2的表达增加。PCR方法检测OsPHYBLOC4332623（引物5-AGGATGGCTCTTTGGTGCTT-3和5-CTCCACCCAGCCATTTTCAG-3），在OsERF2沉默或过表达转基因水稻中的表达动态，发现OsPHYB在OsERF2基因沉默水稻中的表达水平比野生型低3倍左右，而在OsERF2过表达转基因水稻中OsPHYB的表达水平高出野生型3-4倍，表明OsERF2可能通过调控OsPHYB的表达，进而影响水稻的籽粒大小和千粒重。实施例三OsERF2调控水稻籽粒大小与千粒重取同一时期收获的野生型（WT）、OsERF2基因沉默（Ri-1、Ri-2）和过表达（OE1、OE2）转基因水稻种子45度烘干3天。分别取Ri-1、Ri-2、WT、OE1、OE2的20粒饱满的种子进行大小比较（如图所示2），相对于野生型的，OsERF2基因沉默转基因水稻的种子变大，而OsERF2过表达的种子则变小。分别取Ri-1、Ri-2、WT、OE1、OE2的400粒种子进行称重，取三次重复实验的平均值分别作为每种材料的千粒重（如图3所示），相对于野生型的，OsERF2基因沉默的转基因水稻种子的千粒重增加，而OsERF2过表达的种子的千粒重降低。这些表明利用OsERF2基因沉默的转基因技术对水稻种子大小与千粒重的改良具有重要的应用价值。实施例四转基因水稻中OsERF2和OsPHYB的表达水平分析基因表达分析方法：取2周转基因水稻和野生型水稻的叶片，用RNA提取试剂盒MagMAX™TotalRNAIsolationKit提取RNA。采用M-MLV试剂盒合成cDNA。用SYBRPremixExTaqTM在ABIPRISM7000上分析候选基因的表达。PCR条件为95℃4min、95℃15s、59℃30s、72℃30s，共40个循环，以ubiquitin作为内参，用2-∆∆CT法分析基因表达水平。实施例五转基因水稻中OsPHYB基因表达的改变光敏色素是植物感受红光和远红光的重要光受体。水稻光敏色素基因OsPHYA、OsPHYB和OsPHYC在幼苗去黄化、根的向地性和延伸、株型、花期和育性等生长发育过程中发挥重要的调控作用。如OsPHYA突变影响水稻的籽粒数、株高和开花等生长发育过程。水稻中过表达OsPHYA影响转基因水稻的株高和节间长度、每穗花序数和水稻的产量。本发明人发现OsPHYB基因的表达在OsERF2基因沉默水稻中的表达下调，而在OsERF2过表达水稻中的表达上调（图4），表明OsERF2可能通过影响OsPHYB基因的表达在水稻株型、籽粒大小和产量等农艺性状的调控过程中发挥重要作用。中国农业科学院生物技术研究所OsERF2基因调控水稻籽粒大小的应用21750DNA1ATGGCGCGGCCGCAGCAGCGGTATCGCGGCGTGCGGCAGCGCCACTGGGGCTCATGGGTCTCCGAGATCCGCCACCCTCTCCTGAAGACGAGGATCTGGCTGGGCACGTTCGAGACGGCGGAGGACGCGGCACGCGCGTACGACGAGGCGGCGCGGATCATGTGCGGCCCGCGCGTGCGCACCAACTTCCCCCACGACGTCGCCGACGAGGCCGCGCCGCCGCCGCCGCCGCACAGCGCCGCCGCAGCCTCCTCGTCGTTCCTCTCCGCGGCGCTCGTCGCCAAGCTCCACCGCTTCAACCTCGCCTCCGTCCAGGCTGCGCAGCGCGGCAACAGCAACGACGACGACTCCACCACCTCCTCCTCCGCCGCCGCGTCGTCGCGCGCCGTGATTCCGTCCCTTCCCGCCGCCGCCGGCGCATTGGGCAATGCGGCGGCGACGGCGGAGTGGAGCGGCGGGTTCCTCGAGGAGCAGTACGTGGACCAGATGATCGAGGAGCTCCTCGACTCCAACTTCTCCATGGAGATCTCCTGCTGAATGTGCCCTGTTCATCTACCTGTTCTTCTCTGCTCCATCTCCTGTTTCTTTCTCTCTCTCTTTTTTTTCTTTCTTTTTTTTTGTTTTTTTAGTTTAGTAAGCTATGTGAGGAAGAACTCTGATCGAGGTTAGTTTGGTCACAGTGAGTTCTGGAGCAGCTTGTGTATACGGTAGCATCATTTAGAGCATAATAGGGTTGCAGTTGAGACCTTC2178氨基酸2MARPQQRYRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKTRIWLGTFETAEDAARAYDEAARIMCGPRVRTNFPHDVADEAAPPPPPHSAAAASSSFLSAALVAKLHRFNLASVQAAQRGNSNDDDSTTSSSAAASSRAVIPSLPAAAGALGNAAATAEWSGGFLEEQYVDQMIEELLDSNFSMEISC

权利要求：1.一种培育籽粒遗传改良水稻品种的方法，其特征在于，通过基因工程方法将植物中的OsERF2基因进行沉默或基因过表达，以获得籽粒大小改良的植株。2.如权利要求1所述的方法，所述OsERF2基因是其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。3.如权利要求1所述的方法，所述植物为水稻。4.如权利要求1至3任一项所述的方法，所述转基因水稻为籽粒大小提高。5.如权利要求1至3任一项所述的方法，所述转基因水稻为籽粒大小降低。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因工程方法是RNAi干扰方法使基因沉默，使转基因水稻的籽粒大小提高。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因工程方法是通过转基因方法获得，基因过表达，使转基因水稻的籽粒大小降低。8.一种OsERF2基因在制备籽粒大小改良的植株中的应用。9.如权利要求8所述的应用，所述OsERF2基因是其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。10.如权利要求8所述的应用，其是通过RNAi干扰方法使基因沉默，使转基因水稻的籽粒大小提高，或者通过转基因方法获得，基因过表达，使转基因水稻的籽粒大小降低。

百度查询： 中国农业科学院生物技术研究所 OsERF2基因调控水稻籽粒大小的应用