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申请/专利权人：中国科学院成都生物研究所

摘要：本发明公开一种倍半萜环化酶及其制备与应用、2Z,4E‑α‑芷香乙烷合成方法。本发明首先提供倍半萜环化酶BcABA3的氨基酸序列是序列2所示氨基酸序列及其衍生多肽。该酶具有催化法尼基焦磷酸环化合成2Z,4E‑α‑芷香乙烷的功能。同时提供编码倍半萜环化酶氨基酸序列的基因序列。同时提供包含上述氨基酸序列的重组蛋白。同时提供倍半萜环化酶、重组蛋白在以法尼基焦磷酸为底物合成2Z,4E‑α‑芷香乙烷、脱落酸中的应用方法。同时提供含有倍半萜环化酶编码基因的重组表达载体、转化子及其应用。同时提供2Z,4E‑α‑芷香乙烷的合成方法，是以法尼基焦磷酸为底物，由倍半萜环化酶或重组倍半萜环化酶催化。

主权项：1.倍半萜环化酶BcABA3，其特征在于：氨基酸序列是如SEQIDNO.2所示。

全文数据：倍半萜环化酶及其制备与应用、2Z,4Ε-α-芷香乙烷合成方法技术领域[0001]本发明涉及一种倍半萜环化酶、其编码基因、其应用、其制备，涉及以法尼基焦磷酸为底物合成2Ζ，4Ε-α-芷香乙烷的方法。属于微生物化学、天然产物化学领域。背景技术[0002]脱落酸abscisicacid，ABA是一种具有倍半碗结构的植物信号传导分子，是国际公认的植物五大类内源生长调节物质之一，具有两种旋光异构体。存在于植物体内的天然ABA基本上是右旋型+-ABA图1。[0003]天然ABA在细胞工程以及农业生产、生态建设、园林绿化等领域具有巨大的基础和应用价值，但由于其在植物中的含量很低，因而人工合成是其重要来源。现有技术经化学合成的是两种旋光异构体（±-ABA的混合物，其中具有生物活性的+-ABA产率较低，提取过程较复杂，成本极高。因而最终人工合成天然ABA的效率低、成本高。发明内容[0004]本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种倍半萜环化酶、其编码基因、其应用、其制备，该倍半萜环化酶能够以法尼基焦磷酸为底物催化合成脱落酸前体2Z，4Ε-α_2Z,4E-a-i〇nylideneehane,2Z,4E-5-27,67,6-trimethyl-2-cyclohexene-1_yl_3-methyl_2，4-pentadiene,2Z,4E-5-2',6',6甲基-2。环己稀-I基）-3-甲基-2，4-戊二烯，图2，可大大提高人工合成天然ABA的效率，降低成本。[0005]为实现上述目的，本发明首先提供一种倍半萜环化酶及其编码基因，其技术方案如下：[0006]—种倍半萜环化酶BcABA3，其特征在于:氨基酸序列是如下二者之一：[0007]—、如SEQIDNO.2所示；[0008]二、SEQIDNO.2所示氨基酸序列衍生的多肽。[0009]上述倍半萜环化酶是利用高通量测序技术对一种能够大量合成天然脱落酸的灰葡萄孢霉菌遗传改良菌株BotrytiscinereaTBC_20菌种保藏号CGMCCNo.4645进行基因组测序，并对所获得的基因组DNA序列进行生物信息学分析及编码蛋白功能验证后，发现一段与基因bcaba3同源的基因是一个新的倍半萜环化酶编码基因（命名为bcaba3,基因序列SEQIDNO.1。该基因编码的多肽氨基酸序列SEQIDNO.2与已报道的灰葡萄孢霉菌B.cinereaB05.10和T4中的多肽BcABA3分别具有95%和99%的同源性（图3，故也将此多肽命名为BcABA3。对多肽BcABA3进行活性检测和功能研究，发现其具有催化法尼基焦磷酸farnesyldiphosphate，FPP，C15环化合成2Ζ，4Ε-α-]£香乙烧的倍半碗环化酶功能，因此认为BcABA3为一新的倍半萜环化酶。本发明发现该倍半萜环化酶BcABA3的氨基酸序列同时可以是SEQIDNO.2所示氨基酸序列的衍生多肽，即将SEQIDNO.2所示氨基酸残基序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且具有与SEQIDNO.2相同活性的由SEQIDNO.2衍生的氨基酸序列。所涉及的取代和或缺失和或添加的氨基酸残基位于SEQIDNO.2所示的氨基酸序列中任意位置或两端。[0010]—种重组蛋白，其特征在于:是如下二者之一：[0011]一、包含氨基酸序列SEQIDNO.2;[0012]二、包含SEQIDNO.2所示氨基酸序列的衍生多肽。[0013]上重组蛋白中，SEQIDNO.2所示氨基酸序列的衍生多肽是指将SEQIDNO.2所示氨基酸残基序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且具有与SEQIDNO.2相同活性的由SEQIDNO.2衍生的序列。[00M]进一步地，上述重组蛋白还分别包含蛋白标签。本发明试验进一步发现经DNA体外重组技术获得的重组蛋白，当其包含氨基酸序列SEQIDNO.2与蛋白标签时，同样具有上述倍半萜环化酶BcABA3的功能。该重组蛋白也可以是包含SEQIDNO.2所示氨基酸序列的衍生多肽与蛋白标签。一般地，蛋白标签可以是纯化标签和可溶性标签。常用的有由6〜10有六个组氨酸残基组成的融合标签His-tag、GST谷胱甘肽-S-转移酶标签）、FLAG、STREP-II、MBP、CPB、CBD、Ha1〇、NusA、Trx、SUMO、GBI、SETSEP、EGFP、HA、IgG、c-Myc或ProfinityeXact等。[0015]编码上述倍半萜环化酶BcABA3氨基酸序列的基因序列，其特征在于：是如下二者之一：[0016]—、编码区基因序列如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；[0017]二、与SEQIDNO.1序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。[0018]本发明发现编码上述倍半萜环化酶氨基酸序列的基因序列如SEQIDNO.1所示的多核苷酸，也可以是与SEQIDNO.1序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。本发明试验进一步发现，在编码区基因序列SEQIDNO.1上添加蛋白标签的核苷酸标签序列时，也能指导编码具有上述倍半碗环化酶BcABA3功能的蛋白质。一般地，蛋白标签可以是纯化标签和可溶性标签等。常用的有由6〜10个组氨酸残基组成的融合标签HiS-tag、GST谷胱甘肽-S-转移酶标签）、FLAG、STREP-II、MBP、CPB、CBD、Hal。、NusA、Trx、SUMO、GBl、SETSEP、EGFP、HA、IgG、c-Myc或ProfinityeXact等。[0019]由甲轻戊酸mevalonicacid，MVA来源的FPP经环化和或重组产生初始碗类碳骨架步骤是决定脱落酸结构的关键步骤，环化合成的2Ζ，4Ε-α_芷香乙烷是脱落酸的前体。13C标记实验推测FPP经过C-I位的还原，C-4位的去饱和、C-2位的异构以及环化过程形成骨架产物2Ζ，4Ε-α-芷香乙烷。芷香乙烷经历一系列氧化修饰反应最终形成ABA1318O2和13C标记实验推测这一系列氧化反应的0来源于〇2,中间产物包括芷香乙醇、芷香乙酸、1’，4’_反式-ABA-二醇等。[0020]据此，本发明同时提供与本发明倍半萜环化酶BCABA3相关的以下技术方案：[0021]上述倍半萜环化酶BcABA3、重组蛋白在以法尼基焦磷酸为底物合成2Ζ，4Ε-α_芷香乙烷中的应用方法。[0022]上述倍半萜环化酶BcABA3、重组蛋白在以法尼基焦磷酸为底物合成右旋型脱落酸中的应用方法。[0023]本发明还提供含有上述倍半萜环化酶BcABA3编码基因的重组表达载体、转化子，具体技术方案是：[0024]—种重组表达载体，其特征在于:是将上述基因序列克隆到表达载体上获得。[0025]上述重组表达载体为质粒，优选为商品化大肠杆菌表达质粒，进一步优选为pET28a⑴质粒。该重组表达载体在多克隆位点区插入了碱基序列：一、编码区基因序列如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或者二、与SEQIDNO.1序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。[0026]—种转化子，其特征在于:是将上述的重组表达载体转化至受体细胞中获得。[0027]上述转化子的受体细胞可以是原核细胞或真核细胞，前者如大肠杆菌菌株，后者如酵母。该转化子包含基因序列SEQIDNO.1的表达质粒，在诱导条件下可以大量稳定表达本发明倍半萜环化酶。[0028]本发明同时提供上述倍半萜环化酶BcABA3的制备方法，该方法是利用含有基因序列SEQIDNO.1的重组表达载体转化至微生物宿主细胞中，获得可表达本发明倍半萜环化酶的重组微生物细胞，再从重组微生物的培养物中分离出倍半萜环化酶BcABA3,其技术方案如下：[0029]一种倍半萜环化酶BcABA3的制备方法，其特征在于:依如下步骤实施：[0030]步骤S1、获得倍半萜环化酶BcABA3编码基因序列，其碱基序列如SEQIDNO.1所示；[0031]步骤S2、将上述编码基因SEQIDNO.1克隆到表达质粒上，得到重组表达载体；[0032]步骤S3、将重组表达载体转化至受体细胞，构建重组工程菌，表达后对获得的总蛋白进行分离纯化，获得重组的倍半萜环化酶。[0033]上述倍半萜环化酶BcABA3的制备方法中，步骤Sl中倍半萜环化酶BcABA3编码基因序列可通过以灰葡萄孢霉B.cinereaTBC-20菌种保藏号CGMCCNo.4645的DNA、cDNA或RNA为模板扩增克隆得到，也可通过合成获得。[0034]与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1提供了一种倍半萜环化酶BcABA3及其制备方法，该倍半萜环化酶BcABA3具有催化法尼基焦磷酸环化合成2Z，4Ε-α-芷香乙烷的倍半萜环化酶功能。（2提供了倍半萜环化酶BcABA3的编码基因序列。（3提供了包含倍半萜环化酶BcABA3编码基因序列的重组表达载体、转化子。（4提供了利用本发明倍半萜环化酶BcABA3实现的以法尼基焦磷酸为底物合成2Ζ，4Ε-α-芷香乙烷的方法、合成右旋型脱落酸的方法。（5经试验证明，本发明提供的倍半萜环化酶BcABA3具备实验室及工业化用途。附图说明[0035]图1是脱落酸[+-S-ABA]分子结构图。[0036]图2是2Ζ，4Ε-α-芷香乙烷分子结构图。[0037]图3是B.cinereaTBC-20与Β05.10和Τ4的BcABA3蛋白氨基酸序列比对图。[0038]图4是B.cinereaTBC-20菌倍半萜环化酶编码基因的cDNAPCR扩增结果电泳谱图。[0039]图5是带His标签的BcABA3重组蛋白的SDS-PAGE分析图。[0040]图6是BcABA3反应产物正己烷抽提液的GC-MS结果图。[0041]图7是金属离子对BcABA3转化FPP合成2Ζ，4Ε-α-芷香乙烷的影响图。[0042]图8是pH对BcABA3转化FPP合成2Ζ，4Ε-α-芷香乙烷的影响图。[0043]图9是温度对BcABA3转化FPP合成2Ζ，4Ε-α-芷香乙烷的影响图。[0044]图10带GST标签的BcABA3重组蛋白的SDS-PAGE分析图。具体实施方式[0045]下面结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述。[0046]实施例一[0047]倍半萜环化酶BcABA3编码基因克隆。[0048]1、B.cinereaTBC-20菌的培养[0049]取TBC-20单菌落斜面一支（斜面高约8cm，26°C，PDA培养基培养7d后置于4°C保存），用滴管吸取约5ml灭菌水并将斜面上的孢子划下，吹打几次将孢子的混合液混匀，用滴管吸取2ml到装有50ml培养基的250ml三角瓶中，置于26°C摇床180rpm培养。培养50h左右，用5ml移液器按5%接种量的比例将种子液接种到装有50ml培养基的250ml三角瓶中，26°C，180rpm培养。培养基由6.OgL葡萄糖，10gL酵母抽提物，3.OgL可溶性淀粉，I.OgL大豆粉，2.0gL蔗糖，0.5gLNH4NO3和1.0gLKH2P〇4组成。[0050]2、Β·cinereaTBC-20菌基因组DNA的提取[0051]1将B.cinerea接种至PDA固体培养基上，26°C培养5d〜7d。[0052]2将菌丝体刮取至研钵中，迅速用液氮研磨成粉末，转移至IOmL离心管中，加入一定量的DNA抽提液（0.1MTris-HClpH8.0，10mMEDTA，2%SDS，100ygmLProteinaseK，I巯基乙醇，每50mg菌体加500yL抽提液），Vortex振荡混匀，55°C孵育60min。[0053]3用5MNaCl将抽提液的NaCl终浓度调为1.4M，然后加入110体积的10%CTAB溶液，混匀后65°C孵育10miη。加入等体积的氯仿异戊醇，颠倒混匀后冰浴30miη。4°C，15000rmin离心IOmin。[0054]4将上清液转移至另一离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后冰浴30min。[0055]54°C，lOOOOrmin，离心IOmin，弃上清液，将沉淀用70%乙醇洗涤两次，置于空气中干燥，最终加入适量的TE或CldH2O溶解DNA沉淀即可。[0056]3、B.cinereaTBC-20菌RNA的提取[0057]从特定培养时间点的3瓶B.cinereaTBC-20培养摇瓶中各吸取用于测定菌体干重的IOml培养液后将样品混合，抽滤收集全部菌体并用无菌水洗涤3次后用滤纸尽量抽干残留的水，迅速投入用液氮预冷的研钵中，迅速充分研磨，总RNA提取按OMEGA试剂盒FungalRNAKit货号R6840-01产品说明书操作。按OMEGA试剂盒RNase-FreeDNaseISet货号E1091进行柱上DNAaseI消化除去残留DNA13RNA样品提取完成后通过琼脂糖凝胶电泳监测RNA质量，通过NanoDropspectro-photometer和用Agilent2IOOBioanalyzer检测RNA样品的质量和浓度。加入110体积的NaAcpH=4.8和三倍体积的无水乙醇混匀后置于-80°C冻存。[0058]4、倍半萜环化酶BcABA3编码基因克隆[0059]利用同源克隆技术根据保守序列中设计简并引物SC3-F、SC3_R表1从灰葡萄孢霉B.cinereaTBC-20菌种保藏号CGMCCNo.4645的RNA样本中克隆得基因bcaba3的cDNA图4,其中M为DNAmarker:Trans2K@PlusDNAMarker，l为用引物SC3-F和SC3-R扩增的cDNA片段，3为用引物ABA3-F和ABA3-R扩增的DNA片段）。总RNA提取按OMEGA试剂盒FungalRNAKit货号R6840-01产品说明书操作，并进行柱上DNAaseI消化除去残留DNA13RNA样品提取完成后通过电泳监测RNA质量，反转录按TOYOBO高效率逆转录试剂盒ReverTraAce-a-货号FSK-100说明书操作。[0060]表1倍半萜环化酶BCABA3的基因克隆所需序列[0062]PCR反应条件是：94°C4min;94°C30s，56°C30s，68°Clminkb，30次循环；68°C5min。测序发现基因bcaba3基因cDNA序列与DNA序列一致，其碱基序列如SEQIDNo.I所示。[0063]实施例二[0064]倍半萜环化酶BcABA3的表达载体的构建。[0065]确定由实施例一获得的倍半萜环化酶BcABA3碱基序列上所含有的内切酶的酶切位点NcoI、XhoI。[0066]选用pET28a+质粒实验室保存）为表达倍半萜环化酶BcABA3所需的载体。将倍半萜环化酶BcABA3对应碱基序列上所含的酶切位点与该载体上多克隆位点区的酶切位点进行比对，选择表达载体多克隆位点区上含有而倍半萜环化酶BcABA3碱基序列上没有的Nc〇I和Xh〇I位点作为构建质粒的酶切位点。设计含有酶切位点的引物见表2。使用K0Dplus-neo酶购自东洋纺公司进行PCR扩增。[0067]表2倍半萜环化酶BcABA3的基因表达载体构建所需序列[0069]PCR反应条件是：94°C4min;94°C30s，56°C30s，68°Clminkb，30次循环；68°C5min。[0070]将目的碱基序列片段用T4连接酶购自TaKaRa连接到载体中，用OMEGA质粒小量提取试剂盒提取质粒，获得表达重组质粒pET-28a-SC3。[0071]实施例三[0072]大肠杆菌表达质粒的线性化和大肠杆菌的转化，获得含有碱基序列如SEQIDNo.1所示的基因的转化子。[0073]将实施例二所得重组质粒pET-28a-SC3转化到大肠杆菌E.coliBL21DE3菌株实验室保存的感受态细胞采用Inoue方法制备感受态细胞中。具体操作如下：[0074]1用Tip头挑取少量保存于-80°C的Transgene冷冻E.coliDH5a菌体，然后在未添加抗生素的LB平板上划线，把平板倒置于细菌培养箱中培养16h。[0075]2从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5a单菌落（2_3mmindiameter，接种于3mLSOB液体培养基用前加MgCl2中，37°C，250rpm振荡培养7小时，记录㈤值。[0076]3将生长至对数生长后期的菌悬液以1:100的比例接种于25mLSOB液体培养基中，室温250rpm振荡约5h培养至㈤600为0.4-0.5每Ih测量一次，注意提前半小时预冷离心机和枪头，移液管，离心管）。将培养液转入2个15mL离心管中，冰上放置lOmin，然后于4°C，2500g离心5min，弃去上清，用枪头吸干残余的培养基。[0077]4用预冷的TBpH5.6〜7.0溶液（新配制，配时测pH8mL轻轻悬浮细胞（慢速Vortax，冰上放置IOmin后，4°C，2500g离心IOmin，预冷1.5mLEP管。弃上清，用枪头吸干残余的培养基，各加入〇.5mLTB，再各一滴一滴加入37.6yL预冷DMSO终浓度为7%，慢速Vortax轻轻悬浮细胞，冰上放置IOmin。IOOyL分装后用液氮速冻储存于-80°C冰箱。[0078]5取_80°C保存的E.coliDH5a感受态细胞置于冰上;在感受态细胞溶解的同时加入适量预冷的质粒DNA，混合均匀后置于冰上10min;42°C水浴热激30s，立即置于冰上冷却IOmin;加入900yL新鲜SOC培养基，混合均匀后37°C培养30min;将菌液IOOOg离心Imin后弃掉大部分上清，留取IOOyL培养基将菌体重悬后均匀涂布于含相应抗生素的LB平板上，37°C倒置培养过夜。[0079]获得含有碱基序列如SEQIDNo.1所示的基因的转化子。[0080]实施例四[0081]高表达目的倍半萜环化酶BcABA3的大肠杆菌阳性克隆筛选。[0082]阳性克隆子的筛选鉴定采用菌液PCR的方法。挑取抗性平板上的单菌落于含有3mL含相应抗生素液体LB培养基的试管中37°C，200rpm过夜培养，吸取2yL过夜培养的菌液作为PCR反应的模板。设计用于鉴定目标基因的特异引物，采用50yL的PCR体系进行阳性克隆子的鉴定。PCR反应体系是：2.5UEasyTaqDNAPolymeraseTransgene，5yL10XEasyTaqbuffer，2yL菌液，0.25mMdNTP，0.2yM引物和2.5yLofDMSO。[0083]PCR程序是：94cC20min;94cC30s，55cC〜60cC30s，72cClminkb，30次循环；72cC10min〇[0084]PCR产物测序验证。[0085]实施例五[0086]重组倍半萜环化酶BcABA3在大肠杆菌中的诱导表达。[0087]筛选出阳性克隆用LB液体培养基TryptonelO·0gL，Yeastextract5·0gL，NaCl10.〇gL，配制LB固体培养基时另添加15gL琼脂，pH7.037°C摇床扩大培养。当OD6qq达到0.4〜0.6左右时，加入IPTG浓度lmolL使其终浓度达到0.5mmolL，继续培养4h〜6h进行诱导表达。[0088]诱导表达具体操作如下：[0089]1将本实验室前期采用pET_28a+原核表达载体构建好的pET-28a_aba3质粒转化E.coliBL21DE3宿主菌感受态细胞，在含有50ygmLKana的LB平板上挑取单菌落至LB液体培养基中过夜培养并提取质粒进行测序鉴定得到正确的转化子。[0090]2挑取转化子单菌落至5mL含有kana抗性的LB液体培养基中，37°C，200rpm过夜培养，按1:100的比例转接于50mL新鲜LB培养基中，转移至28°C，200rpm扩大培养至0D600为0.4〜0.6，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG至终浓度ImM，开始进行重组蛋白诱导表达，在2h、4h、6h分别取样ImL培养物用以分析诱导表达的最佳时间。[0091]3各个诱导时间取出的ImL培养物12000rpm，离心2min，弃上清后加入ImLIOOmMKH2P〇4-KHP〇4缓冲液（PBKpH=7.0洗涤菌体，再次12000rpm，离心2min，弃上清后加入300mLPBK重悬细胞后进行超声破碎操作条件见实施例六）。4°：，12000rpm离心10min，分别在上清和沉淀中加入蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE分析重组蛋白在上清和沉淀中的分布，最终确定IPTG诱导重组蛋白表达的最佳时间。若在上清中有明显的目的条带，则判断该重组蛋白为可溶性表达，可以放大培养进而纯化目的蛋白。[0092]4可溶性蛋白确定最佳的诱导表达时间后按照上述诱导表达条件进行诱导表达，将诱导后的培养物12000rpm，离心2min，弃上清收集菌体并用IOOmMPBK缓冲液pH=7.0洗涤菌体两次。[0093]512000rpm，离心2min，弃上清后将菌体用裂解液（50mMPBNa缓冲液，pH=8.0，300mMNaCl，lmMPMSF和100ygmL溶菌酶悬浮。[0094]实施例六[0095]重组倍半萜环化酶BcABA3粗酶的制备、纯化、测序。[0096]诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用破胞缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波破碎条件为:超声3s，停5s，40次为一周期，变幅杆为6mm，功率为25%约150w。超声至菌液变清，不再粘稠为止），破胞至菌液澄清，IOOOOrpm离心IOmin，收集上清液。上清液用金属镍亲和层析法纯化目的蛋白。SDS-PAGE电泳检测纯化效果，最终获得目的蛋白BcABA3粗酶（图5,从左到右分别是IMIPTG诱导4h全菌样品；IMIPTG诱导2h全菌样品；IMIPTG诱导4h菌体超声波破碎后上清样品；诱导前全菌样品；箭头所指是亲和纯化获得的BcABA3蛋白）。[0097]实施例七[0098]倍半萜环化酶BcABA3的功能鉴定，具体鉴定实施例六获得的重组蛋白是否具有催化FPP合成2Z，4Ε-α-芷香乙烷的生物学活性。[0099]浓缩BcABA3重组蛋白：经纯化的重组蛋白BcABA3溶液Iml〜lOmlyL，浓度2pmoluL〇[0100]将浓缩BcABA3重组蛋白ΙμΜ〜5μΜ加入酶活反应体系中。酶反应体系成分是：150mMTris-ClρΗ=7·0〜8.0，100mMNaCl，5%glycerol，30mMMgCl2,5mM0-疏基乙醇，20ygmLFPP。混匀后用等体积色谱纯的正己烷覆盖，30°C〜35°C水浴条件下反应0.5h〜4h。[0101]反应结束后将ImL反应液用等体积正己烷萃取三次，萃取液混合后浓缩到200yL用于GCMS检测。检测条件为：IyL不分流进样，初始温度60°C，保持2min;10°Cmin上升到200°C;20°Cmin上升到280°C，保持lOmin。分子量扫描范围30〜450。检测到分子量的产物与MassFinder数据库进行比对。GC-MS的检测发现产物为2Ζ，4Ε-α-芷香乙烷（图6，可检测到副产物2Z，4E，6E-α-allofa;rnesene和2E，4E，6E-α-allofa;rnesene图60[0102]实施例八[0103]倍半萜环化酶BCABA3的功能鉴定，具体鉴定实施例六获得的重组蛋白是否具有催化FPP合成2Ζ，4Ε-α_芷香乙烷的生物学活性。其与实施例七相同之处不再重复，不同之处在于:反应体系中加入ΙμΜ〜5μΜ倍半萜环化酶且不加入30mMMgCl2。[0104]酶反应体系成分如下：150mMTris-ClρΗ=7·0〜8.0，100mMNaCl，5%glycerol，5ηιΜβ-疏基乙醇，60ymolmLFPP。混勾后用等体积色谱纯的正己烧覆盖，30°C〜35°C水浴条件下反应0.5h〜4h。[0105]反应结束后将反应液用等体积正己烷萃取三次，萃取液混合后用于GCMS检测检测操作同实施例七），发现主产物为2Ζ，4Ε-α_芷香乙烷。其与实施例七相同之处不再重复。[0106]实施例七、八结果显示，未加入Mg2+的酶反应体系中芷香乙烷的合成效率是加入Mg2+后合成效率的50%〜60%图8。[0107]图7是相同反应体系中选择不同金属离子及对照组的结果显示。图7显示，Mg2+Xa2+能促进合成，Al3+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+会抑制合成。[0108]实施例九[0109]倍半萜环化酶BCABA3的功能鉴定，具体鉴定实施例六获得的重组蛋白是否具有催化FPP合成2Ζ，4Ε-α-芷香乙烷的生物学活性。其与实施例七相同之处不再重复。[0110]将浓缩BcABA3重组蛋白ΙμΜ〜5μΜ加入酶活反应体系中。酶反应体系成分是：150mMTris-ClρΗ=8·0〜9.0，100mMNaCl，5%glycerol，30mMMgCl2,5mM0-疏基乙醇，20ygmLFPP。混匀后用等体积色谱纯的正己烷覆盖，30°C〜35°C水浴条件下反应Ih〜4h。反应结束后将等体积的正己烷萃取三次，萃取液混合后真空浓缩获得产物为2Z，4Ε-α-芷香乙烷。[0111]实施例七、九结果显示，加入Tris-ClρΗ=8.5〜9.5的酶反应体系中芷香乙烷的合成效率是加入Tris-ClρΗ=7.0〜8.0合成效率的50%〜70%图8。[0112]图8是相同反应体系选择不同pH条件的试验结果。图8显示，pH=7.0〜8.0是较优条件，但在pH=5.0〜10.0条件下均能有效合成2Z，4Ε-α-芷香乙烷。[0113]实施例十[0114]倍半萜环化酶BcABA3的功能鉴定，具体鉴定实施例六获得的重组蛋白是否具有催化FPP合成2Ζ，4Ε-α-芷香乙烷的生物学活性。其与实施例七相同之处不再重复。[0115]将浓缩BcABA3重组蛋白ΙμΜ〜5μΜ加入酶活反应体系中。酶反应体系成分是：150mMTris-ClρΗ=7·0〜8.0，100mMNaCl，5%glycerol，30mMMgCl2,5mM0-疏基乙醇，20ygmLFPP。混匀后用等体积色谱纯的正己烷覆盖，25°C反应结束后将等体积的正己烷萃取三次，萃取液混合后真空浓缩获得产物为2Z，4Ε-α-芷香乙烷。[0116]实施例七、十结果显示，25°C反应合成芷香乙烷的效率是30°C〜35°C水浴条件下反应合成效率的50%左右（图9。[0117]图9是相同反应体系下选择不同反应温度的试验结果。图9显示，30°C〜35°C是较优条件，但在15°C〜50°C条件下均能有效合成2Z，4Ε-α-芷香乙烷。[0118]实施例^^一[0119]带GST蛋白标签的倍半萜环化酶BcABA3制备。[0120]选用PGEX-6P-1质粒实验室保存）为表达倍半萜环化酶BcABA3所需的载体。设计引物见表3。使用KODplus-neo酶来源东洋纺公司进行PCR扩增。[0121]表3倍半萜环化酶BcABA3的基因表达载体构建所需序列[0123]PCR反应条件是：94°C4min;94°C30s，56°C30s，68°Clminkb，30次循环；68°C5min。[0124]将目的碱基序列片段连接到载体中，用OMEGA质粒小量提取试剂盒提取质粒，获得表达重组质粒pGEX-SC3。将重组质粒pGEX-SC3转化到大肠杆菌E·coliRosettaDE3Cat·Nos.CD801-03,TransgenBiotechCo.,Ltd.,China的感受态细胞中。Amp抗性LB平板筛选阳性克隆，采用菌液PCR方法进行鉴定。[0125]过夜培养pGEX-SC3单克隆（37°C，培养12h，转接于LB摇瓶中（IOOml〜200ml，37。:培养4h0D600=0.6〜0.8后加入IPTG诱导（终浓度1%。，37°C20h〜24h，离心收集菌体8000rpmIOmin4°C，加入15mllxros，进行超声破碎操作条件见实施例六），用GST亲和纯化试剂盒纯化获得重组蛋白GST-BcABA3图10，M为蛋白Marker;l为pGEX-SC3Rosetta诱导Oh全菌样品；2为pGEX-SC3RosettaIPTG诱导20h全菌样品；3为ABA3蛋白纯化样品）。[0126]实施例十二[0127]带标签的倍半萜环化酶BcABA3功能鉴定，具体鉴定实施例九获得的重组蛋白是否具有催化FPP合成2Z，4Ε-α-芷香乙烷的生物学活性。[0128]实施例十所得重组蛋白GST-BcABA3经标签切除后（GE公司的prescissionprotease;或sigma公司的thrombiη，按照实施例七的方法验证活力。将浓缩BeABA3重组蛋白ΙμΜ加入酶活反应体系中。酶反应体系成分如下：150mMTris-ClpH=7.0〜8.0，100mMNaCl，5%glycerol，30mMMgCh，5ηιΜβ-疏基乙醇，60ymolmLFPP。混勾后用等体积色谱纯的正己烷覆盖，35°C水浴条件下反应2h。[0129]反应结束后将反应液用等体积正己烷萃取三次，萃取液混合后浓缩进行GCMS检测，发现主产物为2Z，4Ε-α-芷香乙烷。[0130]实施例七、十一结果显示，GST纯化蛋白的合成效率是his标签纯化蛋白合成效率的90%〜100%。[0131]序列表[0132]SEQIDNO.1[0133]DNA[0134]〈213灰葡萄抱霉菌BotrytiscinereaTBC-20[0138]〈213灰葡萄抱霉BotrytiscinereaTBC-20

权利要求：1.倍半萜环化酶BcABA3，其特征在于:氨基酸序列是如下二者之一：一、如SEQIDNO.2所示；二、SEQIDNO.2所示氨基酸序列衍生的多肽。2.编码权利要求1所述的倍半萜环化酶BcABA3氨基酸序列的基因序列，其特征在于:是如下二者之一：一、编码区基因序列如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；二、与SEQIDNO.1序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。3.重组蛋白，其特征在于:是如下二者之下：一、包含氨基酸序列SEQIDNO.2;二、包含SEQIDNO.2所示氨基酸序列衍生的多肽。4.权利要求1所述的倍半萜环化酶BcABA3、权利要求3所述的重组蛋白在以法尼基焦磷酸为底物合成2Ζ，4Ε-α-芷香乙烷或脱落酸中的应用方法。5.权利要求4所述的应用方法，其特征在于:所述脱落酸是右旋型脱落酸。6.重组表达载体，其特征在于：是将权利要求2所述的基因序列克隆到表达载体上获得。7.转化子，其特征在于:是将权利要求6述的重组表达载体转化至受体细胞中获得。8.权利要求6所述的重组表达载体、权利要求7所述的转化子在制备倍半萜环化酶中的应用方法。9.2Ζ，4Ε-α_芷香乙烷的合成方法，其特征在于：以法尼基焦磷酸为底物，由倍半萜环化酶BcABA3或重组倍半萜环化酶BcABA3催化;酶催化条件15°C〜50°C、pH5.0〜10.0。10.根据权利要求9所述的合成方法，其特征在于:反应体系中加入Mg2+和或Ca2+激活倍半萜环化酶BcABA3活性，或者反应体系中不含有Al3+和或Zn2+和或Mn2+和或Cu2+和SFe2+〇

百度查询： 中国科学院成都生物研究所 倍半萜环化酶及其制备与应用、2Z,4E-α-芷香乙烷合成方法