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申请/专利权人：中国科学院华南植物园

摘要：本发明公开了一种高效、高清晰度的观察植物花粉管在雌蕊内生长情况的荧光显微方法。本发明的荧光显微方法大大地弱化了雌蕊自身组织发光的现象，减少了其在较大放大倍数时对花粉管观察的干扰，从而容易取得高放大倍数下花粉管体内生长的高清晰度的影像，对细节的呈现效果非常理想。本发明的荧光显微方法将软化透明时间极大地缩短至几个小时，且染色的时间也从现有技术的数小时缩短至几分钟，使得观察实验在1天内即可完成，大幅地提高了实验效率，同时避免了使用高浓度的NaOH溶液，软化透明过程中材料大小能保持原始状态，故不会出现失水收缩的现象也无需进行复水处理。

主权项：1.一种观察植物花粉管在雌蕊内生长情况的荧光显微方法，其特征在于，包括以下步骤：1将待观察植物授粉后的雌蕊作为待检材料，浸没于FAA固定液中固定4h以上；所述的FAA固定液包括体积分数50％的乙醇水溶液、冰乙酸和甲醛，所述的体积分数50％的乙醇水溶液、冰乙酸和甲醛的体积比为18:1:1；所述的待观察植物为海岸桐、野牡丹、玉叶金花或洋桔梗；2将固定后的待检材料用蒸馏水清洗后，将待检材料置于容器中；向装有待检材料的容器中加入质量分数10％的无水亚硫酸钠溶液，用量以全部浸没待检材料为准，然后将容器置于90-100℃水浴直到待检材料软化至黄色近半透明状果冻状后取出；3吸走容器中的无水亚硫酸钠溶液，用蒸馏水洗涤后，加入质量分数0.1％的无色苯胺蓝染液染色1-5分钟；4将染色好的待检材料取出置于载玻片上，滴加质量分数75％的甘油溶液后用盖玻片压片，在紫外光下进行荧光显微观察。

全文数据：一种高效、高清晰度的观察植物花粉管在雌蕊内生长情况的荧光显微方法技术领域：本发明属于植物显微技术领域，具体涉及一种高效、高清晰度的观察植物花粉管在雌蕊内生长情况的荧光显微方法。背景技术：花粉管在雌蕊内的生长情况一般利用荧光显微观察法观察。花粉管中特有的胼胝质与无色苯胺蓝中的荧光色素结合，在紫外光下激发出明亮的蓝绿色荧光，而雌蕊中的其他组织不含或少含胼胝质从而不发光或弱发光。通过这种技术，可对花粉管在雌蕊内生长情况进行有效的观察，是研究植物自交亲和性和受精过程等重要生理过程的必要手段。传统的花粉管荧光显微技术，对植物材料如花柱和子房的简单软化透明后，经苯胺蓝染料染色后滴加苯胺蓝染液直接压片后于荧光显微镜下观察。传统方法中，一般利用NaOH溶液进行浸泡软化，所需时间长，特别对于花柱直径大于1毫米的粗壮材料，少则一两天多则十几天，且长时间的浸泡也未必能得到理想的观察效果。也有人在软化前使用NaClO进行透明处理，但不管哪种方式，在这类传统方法处理后，无法避免某些维管束组织发达的粗壮花柱或子房中自身组织的自发强荧光，因而干扰对花粉管的观察，有的甚至无法分辨花粉管与花柱组织。因此观察效果欠佳，很难精确到单根花粉管的细节。发明内容：本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种高效、高清晰度的观察植物花粉管在雌蕊内生长情况的荧光显微方法。本发明的观察植物花粉管在雌蕊内生长情况的荧光显微方法，包括以下步骤：1将待观察植物授粉后的雌蕊作为待检材料，浸没于FAA固定液中固定4h以上；本步骤在于固定待检材料组织结构，并消除待检材料中叶绿素以免其在后续荧光观察时自发红色荧光影响观察效果。2将固定后的待检材料用蒸馏水清洗后，将待检材料置于容器中，向装有待检材料的容器中加入质量分数10％的无水亚硫酸钠溶液，用量以全部浸没待检材料为准，然后将容器置于90-100℃水浴直到待检材料软化至黄色近半透明状果冻状后取出；软化过程中，溶液会渐渐变成黄褐色；视材料大小，时间在2-3h左右即可达到理想状态。本步骤在于软化透明材料，便于后续压片观察，且弱化组织自发荧光现象。4吸走容器中的无水亚硫酸钠溶液，用蒸馏水洗涤后，加入脱色苯胺蓝染液染色1-5分钟；软化透明好的材料，染色迅速，几分钟即可。过长的染色时间反而会使得花粉管以外的组织染上色素从而荧光观察时也发荧光，影响对花粉管的观察效果。5将染色好的待检材料取出置于载玻片上，滴加甘油溶液后用盖玻片压片，在紫外光下进行荧光显微观察。甘油封片可增加镜下观察的透明度，保证较大放大倍数时观察的清晰度，且片子保存时不会因为失水变干。优选，所述的FAA固定液包括体积分数50％的乙醇水溶液、冰乙酸和甲醛，所述的体积分数50％的乙醇水溶液、冰乙酸和甲醛的体积比为18:1:1。所述的脱色苯胺蓝染液优选为质量分数0.1％的无色苯胺蓝染液。所述的甘油溶液优选为质量分数75％的甘油水溶液。所述的固定的时间优选为4～8h。所述的待观察植物优选为海岸桐、野牡丹、玉叶金花或洋桔梗。所述的容器优选为2.5mL离心管。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：首先，本发明采用了与现有技术截然不同的材料软化透明方法，该方法处理下植物雌蕊自身组织发光现象被大大地弱化，减少了其在较大放大倍数时对花粉管观察的干扰，从而容易取得高放大倍数下花粉管雌蕊内生长的高清晰度的影像，对细节的呈现效果非常理想。其次，本发明将软化透明时间极大地缩短至几个小时，且染色的时间也从现有技术的数小时缩短至几分钟，使得观察实验在1天内即可完成，大幅地提高了实验效率。再者，本发明的荧光显微方法避免了使用高浓度的NaOH溶液，软化透明过程中材料大小能保持原始状态，故不会出现失水收缩的现象也无需进行复水处理。此外，在封片观察时，现有技术采用苯胺蓝染液封片，但本发明采用甘油封片，因质量分数75％的甘油水溶液具有与玻璃相近的折射率，大大地改善了观察时的透明度，使得显微成像效果得以进一步改善。附图说明：图1是实施例1不采用FAA固定液固定时海岸桐雌蕊组织中花粉管生长情况×100倍；其中A为自发红色荧光的叶绿素。图2是实施例2的海岸桐授粉后的柱头和花柱中花粉管生长情况×40倍。图3是实施例2的海岸桐授粉后柱头局部中花粉管生长情况×40倍；其中A为传统方法处理；B为本实施例的荧光显微方法处理。图4是实施例2的海岸桐授粉后柱头局部高放大倍数下花粉管观察的效果；其中1&2为放大100倍，3&4为放大200倍。图5是实施例3的野牡丹授粉后柱头局部中花粉管生长情况；其中A-1为传统方法处理×100倍，A-2为传统方法处理×200倍，B-1为本实施例的荧光显微方法处理×100倍，B-2为本实施例的荧光显微方法处理×200倍。图6是实施例4的玉叶金花授粉后花柱局部中花粉管生长情况；其中A-1为传统方法处理×200倍，A-2为传统方法处理×400倍，B-1为本实施例的荧光显微方法处理×200倍，B-2为本实施例的荧光显微方法处理×400倍。图7是实施例5的洋桔梗授粉后花柱局部中花粉管生长情况；其中A-1为传统方法处理×100倍，A-2为传统方法处理×200倍，B-1为本实施例的荧光显微方法处理×100倍，B-2为本实施例的荧光显微方法处理×200倍。图8为实施例5的洋桔梗授粉后子房局部中花粉管生长情况；其中A-1为传统方法处理×100倍，A-2为传统方法处理×200倍，B-1为本实施例的荧光显微方法处理×100倍，B-2为本实施例的荧光显微方法处理×200倍。具体实施方式：以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1：选取授粉12h后的海岸桐花朵，剥离花瓣等，仅留下雌蕊部分作为待检材料，将待检材料置于2.5mL离心管中，加入质量分数10％的无水亚硫酸钠溶液，用量以全部浸没待检材料为准，然后将离心管置于100℃水浴2h后取出，待检材料软化变成黄色近半透明状果冻状。吸走管中的无水亚硫酸钠溶液，用蒸馏水小心洗涤3次后，加入质量分数0.1％的无色苯胺蓝染液质量分数0.1％的无色苯胺蓝染液的配制：称取0.1g苯胺蓝溶于99.9g浓度为0.033molL的K3PO4水溶液中，制备得到质量分数0.1％的苯胺蓝染液，避光放置至脱色后，得到质量分数0.1％的无色苯胺蓝染液，避光保存备用染色2分钟。用镊子小心取出待检材料置于载玻片上，滴加质量分数75％的甘油水溶液后用盖玻片压片，在紫外光下进行荧光显微观察图1。从图1中可以看出，若不采用FAA固定液固定，海岸桐雌蕊组织中含有大量的叶绿素，在荧光观察时，叶绿素自发红色荧光影响观察效果。实施例2：选取授粉12h后的海岸桐花朵，剥离花瓣等，仅留下雌蕊部分作为待检材料，浸没于FAA固定液FAA固定液是由体积比18:1:1的体积分数50％的乙醇水溶液、冰乙酸和甲醛混合而成中固定4h，取出固定后的待检材料，用蒸馏水清洗3次，将待检材料置于2.5mL离心管中，加入质量分数10％的无水亚硫酸钠溶液，用量以全部浸没待检材料为准，然后将离心管置于90℃水浴2h后取出，待检材料软化变成黄色近半透明状果冻状。吸走管中的无水亚硫酸钠溶液，用蒸馏水小心洗涤3次后，加入质量分数0.1％的无色苯胺蓝染液配制方法同实施例1染色2分钟。用镊子小心取出待检材料置于载玻片上，滴加质量分数75％的甘油水溶液后用盖玻片压片，在紫外光下进行荧光显微观察图2-4。从图2-4中可以看出，本实施例的荧光显微方法处理可见仅有花粉管发光而花柱和柱头组织几乎不发光，也无叶绿素发光，花粉管的成像效果十分清晰。与传统方法CN201310236666.2中公开的荧光显微方法相比，明显可见传统方法虽可见花粉管，但是花柱组织发光很强会对花粉管遮挡，而本实施例的荧光显微方法花柱组织几乎不发光，而且在高放大倍数下可以获得良好的暗场，使得花粉管的成像十分清晰。实施例3：选取授粉12h后的野牡丹花朵，剥离花瓣等，仅留下雌蕊部分作为待检材料，浸没于FAA固定液FAA固定液是由体积比18:1:1的体积分数50％的乙醇水溶液、冰乙酸和甲醛混合而成中固定8h，取出固定后的待检材料，用蒸馏水清洗5次，将待检材料置于2.5mL离心管中，加入质量分数10％的无水亚硫酸钠溶液，用量以全部浸没待检材料为准，然后将离心管置于100℃水浴3h后取出，待检材料软化变成黄色近半透明状果冻状。吸走管中的无水亚硫酸钠溶液，用蒸馏水小心洗涤5次后，加入质量分数0.1％的无色苯胺蓝染液配制方法同实施例1染色1分钟。用镊子小心取出待检材料置于载玻片上，滴加质量分数75％的甘油水溶液后用盖玻片压片，在紫外光下进行荧光显微观察图5。从图5中可以看出，与传统方法CN201310236666.2中公开的荧光显微方法相比，传统方法下处理，花粉管因花柱和柱头组织发光干扰，成像模糊不清晰，而本实施例的荧光显微方法处理花粉管根根分明。而且传统方法处理，雌蕊组织发生收缩，在同等倍数下可见组织和花粉管变小很多。实施例4：选取授粉12h后的玉叶金花花朵，剥离花瓣等，仅留下雌蕊部分作为待检材料，浸没于FAA固定液FAA固定液是由体积比18:1:1的体积分数50％的乙醇水溶液、冰乙酸和甲醛混合而成中固定4h，取出固定后的待检材料，用蒸馏水清洗3次，将待检材料置于2.5mL离心管中，加入质量分数10％的无水亚硫酸钠溶液，用量以全部浸没待检材料为准，然后将离心管置于100℃水浴2h后取出，待检材料软化变成黄色近半透明状果冻状。吸走管中的无水亚硫酸钠溶液，用蒸馏水小心洗涤3次后，加入质量分数0.1％的无色苯胺蓝染液配制方法同实施例1染色5分钟。用镊子小心取出待检材料置于载玻片上，滴加质量分数75％的甘油水溶液后用盖玻片压片，在紫外光下进行荧光显微观察图6。从图6中可以看出，与传统方法CN201310236666.2中公开的荧光显微方法相比，可见传统方法下，高倍数时，花粉管因花柱组织的遮挡，除了明亮的胼胝质塞在拍照时可见，几乎无法辨认花粉管，而本实施例的荧光显微方法处理下花粉管结构清晰，根根分明。实施例5：选取授粉12h后的洋桔梗花朵，剥离花瓣等，仅留下雌蕊部分作为待检材料，浸没于FAA固定液FAA固定液是由体积比18:1:1的体积分数50％的乙醇水溶液、冰乙酸和甲醛混合而成中固定4h，取出固定后的待检材料，用蒸馏水清洗3次，将待检材料置于2.5mL离心管中，加入质量分数10％的无水亚硫酸钠溶液，用量以全部浸没待检材料为准，然后将离心管置于100℃水浴3h后取出，待检材料软化变成黄色近半透明状果冻状。吸走管中的无水亚硫酸钠溶液，用蒸馏水小心洗涤3次后，加入质量分数0.1％的无色苯胺蓝染液配制方法同实施例1染色2分钟。用镊子小心取出待检材料置于载玻片上，滴加质量分数75％的甘油水溶液后用盖玻片压片，在紫外光下进行荧光显微观察图7-8。从图7-8中可以看出，与传统方法CN201310236666.2中公开的荧光显微方法相比，可见传统方法下，花柱和子房组织遮挡，成像模糊，难以取得单根花粉管的清晰成像，而本实施例的荧光显微方法所得影像花粉管结构清晰。

权利要求：1.一种观察植物花粉管在雌蕊内生长情况的荧光显微方法，其特征在于，包括以下步骤：1将待观察植物授粉后的雌蕊作为待检材料，浸没于FAA固定液中固定4h以上；2将固定后的待检材料用蒸馏水清洗后，将待检材料置于容器中；向装有待检材料的容器中加入质量分数10％的无水亚硫酸钠溶液，用量以全部浸没待检材料为准，然后将容器置于90-100℃水浴直到待检材料软化至黄色近半透明状果冻状后取出；3吸走容器中的无水亚硫酸钠溶液，用蒸馏水洗涤后，加入脱色苯胺蓝染液染色1-5分钟；4将染色好的待检材料取出置于载玻片上，滴加甘油溶液后用盖玻片压片，在紫外光下进行荧光显微观察。2.根据权利要求1所述的观察植物花粉管在雌蕊内生长情况的荧光显微方法，其特征在于，所述的FAA固定液包括体积分数50％的乙醇水溶液、冰乙酸和甲醛，所述的体积分数50％的乙醇水溶液、冰乙酸和甲醛的体积比为18:1:1。3.根据权利要求1所述的观察植物花粉管在雌蕊内生长情况的荧光显微方法，其特征在于，所述的脱色苯胺蓝染液为质量分数0.1％的无色苯胺蓝染液。4.根据权利要求1所述的观察植物花粉管在雌蕊内生长情况的荧光显微方法，其特征在于，所述的甘油溶液为质量分数75％的甘油水溶液。5.根据权利要求1～4任一项所述的观察植物花粉管在雌蕊内生长情况的荧光显微方法，其特征在于，所述的待观察植物为海岸桐、野牡丹、玉叶金花或洋桔梗。6.根据权利要求1所述的观察植物花粉管在雌蕊内生长情况的荧光显微方法，其特征在于，所述的容器为2.5mL离心管。

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