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申请/专利权人：南京农业大学

摘要：本发明涉及一种促进AIV和或NDV疫苗的免疫反应的法氏囊活性五肽及应用。本发明所述的法氏囊活性五肽，氨基酸组成为MetProProThrHis，结构简单，免疫原性极弱。本发明活性肽具有促进疫苗免疫反应的功能，在小鼠免疫实验中，不仅促进免疫小鼠产生AIV特异的抗体反应，而且促进免疫小鼠产生NDV特异的抗体反应。此外，还促进细胞免疫反应、抗原递呈反应，并提高免疫鸡的疫苗免疫效力，可作为疫苗佐剂或免疫增强剂应用于动物疫苗应用研究，以提高动物机体针对特异抗原的免疫应答能力，提高疫苗的免疫效力，从而提高动物机体抗疫病感染的能力。

主权项：1.一种法氏囊多肽五肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。

全文数据：一种促进AIV和或NDV疫苗的免疫反应的法氏囊活性五肽及应用技术领域本发明属于兽医生物制品技术领域，具体涉及一种具有促进疫苗AIV和或与NDV二联疫苗的免疫反应的法氏囊活性五肽及其应用。背景技术禽流感avianinfluenza，AI是由正粘病毒科A型流感病毒Avianinfluenzavirus，AIV引起的禽类高度接触性传染病,其临床症状不均一，有的不表现出临床症状，有的表现为产蛋下降和呼吸道疾病，甚至导致全身性疾病，死亡率可达100％。根据致病性的不同，可分为高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒。目前，中国的低致病性禽流感疫情主要以H9亚型为主。该亚型禽流感病毒虽然不引起感染的禽类大量死亡，但是由于该病毒传播能力极强，存在范围极广，导致产蛋下降、免疫抑制病、与其他病原共感染时常导致高死亡率，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。禽流感是传播速度快，感染率高变异性极高的一种急性传染病。随着药物用量加大，病毒变异的能力也在加强。令人关注的是2013年中国暴发的H7N9禽流感，其能感染人并导致人类死亡。通过对其各个片段的基因分析发现，发现其内部基因与H9N2高度同源，也证实了该病毒已经发生了重组。这些大量报道禽流感病毒跨越种间障碍直接传播给了人类的事件，已经越来越多的引起了社会的关注，而其对应的公共卫生意义也日益突显。禽流感不仅禽类发生，人类也会被感染，随着候鸟迁徙以及牲畜间的相互传播，使禽流感防控日益严峻。近年来由于我国农业产业结构不断调整，畜牧规模化水平不断提高，尤其是养鸡场数量不断增加，鸡的染病率升高，尤其禽流感风险极大。因此国家必须加大对禽流感的研究与防控。接种疫苗是预防禽流感发生与传播最有效的手段之一，对提高我国的禽病防制水平，和保障我国养禽业的健康发展有十分积极的意义。临床应用表明，现有的H9N2亚型AIV灭活疫苗免疫鸡只后，尽管能使鸡只产生较高的抗体，但已经不能有效地保护其免受当前H9N2亚型AIV流行株的攻击。而且，使用单苗免疫会消耗大量人力物力，免疫次数的增加的同时会加强鸡群的应激反应。因而，提供一种价格低、安全、无残留的高效促进疫苗免疫效果的新型活性肽，可作为疫苗佐剂或免疫增强剂应用于动物疫苗应用研究，以提高动物机体针对特异抗原的免疫应答能力，提高疫苗的免疫效力，从而提高动物机体抗疫病感染的能力，可应用于基础免疫研究、临床应用研究等领域。发明内容本发明的目的在于提供一种安全可靠、价格低廉、无残留的高效促进疫苗免疫效果的新型活性肽，作为疫苗佐剂或免疫增强剂应用于动物疫苗应用研究，以此提高动物机体针对特异抗原的免疫应答能力，从而提高动物机体抗疫病感染的能力，可应用于基础免疫研究、临床应用研究等领域。本发明所述的法氏囊多肽可用于H9N2亚型禽流感病毒、新城疫经典毒株LaSota的二联灭活疫苗，H9N2亚型禽流感灭活疫苗、新城疫灭活疫苗等，并对它们的免疫效果进行初探，以期为后续的灭活疫苗研制提供依据。本发明所述的目的通过以下方案实现：一种法氏囊多肽五肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，为：5’-MetProProThrHis-3’。本发明所述法氏囊多肽五肽在制备免疫疫苗药物中的应用，优选的在制备畜禽免疫疫苗中的应用，特别优选在制备预防禽流感和或新城疫的疫苗佐剂中的应用。一种预防禽流感的免疫组合物，包含禽流感疫苗和或新城疫的疫苗，及本发明所述的法氏囊多肽五肽。本发明所述法氏囊多肽五肽优选以2～255μgmL计量存在于免疫组合物中，更优选10～250μgmL，进一步优选50～250μgmL。在一种具体的实施方式中，本发明所述的法氏囊多肽五肽可以以以下计量存在于免疫组合物中：50ugmL、100ugmL、150ugmL、200ugmL、250ugmL。本发明通过超滤、分子筛等技术，回收分子量小于1kDa的有效成分即粗提物。经真空干燥浓缩，然后采用反向高效液相色谱RP-HPLC进行分离、纯化，收获洗脱峰值时间为10.067分钟的法氏囊多肽成分。经MODIL-TOF质谱分析，测定该法氏囊活性肽的分子量为581.30mz，并进一步通过MSMS分析，获得了完整的氨基酸序列，MPPTH即5’-MetProProThrHis-3’，序列1，并命名为法氏囊五肽五肽。本发明还提供一种更为具体的法氏囊多肽五肽的制备：以50g健康肉鸡法氏囊组织为原料，剪去脂肪组织后，采用冷冻、超声破碎、高速离心、液体上清分子筛分离等技术，获得分子量小于1KDa的法氏囊多肽粗提物。经真空冷冻干燥，用超纯水稀释法氏囊粗提物样品进行反向高效液相色谱RP-HPLC分离纯化，收获洗脱峰值比较高的滞留峰组分。本发明中样品的滞留时间为10.067分钟。利用蛋白质氨基酸质谱分析系统MALDI-TOF-MS分析该样品的氨基酸序列，测定该法氏囊活性肽的分子量为581.30mz，并采用MSMS分析，获得该法氏囊多肽的完整氨基酸序列，即MPPTH。通过人工合成五肽，纯度为97％，接着进行免疫实验验证其免疫调节功能及应用。本发明所述的法氏囊多肽五肽促进禽流感和新城疫二联疫苗的小鼠免疫实验证明：将新分离的法氏囊多肽五肽按照10、50和250μgmL三种剂量添加至禽流感和新城疫二联疫苗中进行联合接种小鼠；免疫后的小鼠的AIV抗体水平、NDV抗体亚型高于疫苗组，且T细胞亚型发生了变化，而且树突状细胞表面分子表达水平高于疫苗组。在小鼠免疫中，添加50μgmL剂量五肽的实验组AIV疫苗免疫效力显著高于未加该组分的疫苗对照组，且添加50μgmL剂量五肽的实验组NDV疫苗的抗体水平显著高于未加该组分的疫苗对照组。本发明所述的法氏囊多肽五肽促进禽流感和新城疫二联疫苗的鸡免疫实验证明：将新分离的法氏囊多肽五肽按照50μgmL添加至禽流感和新城疫二联疫苗中进行联合接种21日龄鸡；免疫后的鸡的AIV抗体水平、NDV抗体亚型高于疫苗组，且鸡群精神状态正常，无不良反应。本发明的积极意义：本发明从鸡法氏囊组织中分离、鉴定出一个新的免疫活性肽五肽，结构简单，由五个氨基酸组成，促进疫苗免疫反应，可作为畜禽疫苗免疫增强剂，如促进AIV灭活疫苗和新城疫灭活疫苗的免疫活性，同时在小鼠免疫实验中，不仅促进免疫小鼠产生针对AIV抗原的强烈抗体反应，而且促进小鼠产生针对NDV抗原的强烈抗体反应。此外，还促进小鼠T细胞免疫反应、抗原递呈反应和提高疫苗免疫效力作用。再者，该多肽促进及鸡产生针对AIV抗原和NDV抗原的强烈免疫反应，以提高动物机体针对特异抗原的免疫应答能力，从而提高动物机体抗疫病感染的能力，可应用于基础免疫研究、临床应用研究等领域。本发明所述的活性肽是一种来源于法氏囊的小分子多肽，安全、副作用小、无残留、具有促进广泛的免疫增强作用，对多种畜禽具有刺激抗体生成、调节细胞免疫反应和提高疫苗免疫效力作用，该多肽的氨基酸序列为：5’-MPPTH-3’，可作为疫苗佐剂或免疫增强剂应用于动物疫苗应用研究，以提高动物机体针对特异抗原的免疫应答能力，提高疫苗的免疫效力，从而提高动物机体抗疫病感染的能力。附图说明图1：法氏囊五肽的分离和纯化。反向高效液相色谱图中，箭头所指，五肽的洗脱峰10.067min。图2：多肽五肽的MALDI-TOF-MSMS分析。图3：免疫后4周，小鼠AIVELISA特异抗体水平，用不同字母标记的各组之间差异显著p南京农业大学一种促进AIV和或NDV疫苗的免疫反应的法氏囊活性五肽及应用1SIPOSequenceListing1.015PRT人工序列ArtificialSequence1MetProProThrHis15

权利要求：1.一种法氏囊多肽五肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.权利要求1所述法氏囊多肽五肽在制备免疫药物中的应用。3.权利要求1所述法氏囊多肽五肽在制备畜禽免疫药物中的应用。4.权利要求1所述法氏囊多肽五肽在制备预防禽流感和或新城疫的疫苗佐剂应用。5.一种预防禽流感的免疫组合物，其特征在于，包含禽流感和或新城疫疫苗，及权利要求1所述的法氏囊多肽五肽。6.根据权利要求5所述的免疫组合物，其特征在于，所述法氏囊多肽五肽以2～255μgmL计量存在于免疫组合物中。7.根据权利要求6所述的免疫组合物，其特征在于，所述法氏囊多肽五肽以10～250μgmL计量存在于免疫组合物中。8.根据权利要求7所述的免疫组合物，其特征在于，所述法氏囊多肽五肽以50～250μgmL计量存在于免疫组合物中。9.根据权利要求8所述的免疫组合物，其特征在于，所述法氏囊多肽五肽以50μgmL计量存在于免疫组合物中。

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