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申请/专利权人：青岛市中心血站

摘要：本发明的目的是提供一种用于检测类孟买血型的基因多态性位点标记，此基因多态性位点标记是FUT1基因编码区域由起始密码子起第749‑765位碱基缺失，导致氨基酸密码子开放阅读框移位导致263位氨基酸密码子变为终止密码子TAA而使α‑1,2岩藻糖基转移酶截短。本发明通过检测筛选获得的基因多态性位点标记，提供了一种有效的进行类孟买血型基因诊断途径，应用效果表明本发明所提供的基因的多态性位点标记及检测引物可以有效的用于临床患者及血站献血员进行FUT1基因的快速检测。

主权项：1.检测类孟买血型的基因多态性位点的制剂在制备检测红细胞类孟买血型的制品中的应用，其特征在于，所述的多态性位点是FUT1基因的编码区域由起始密码子起第749-765位碱基发生缺失；其中第749-765位碱基的序列为GGGCACGGCACGAAGCC。

全文数据：一种用于检测类孟买血型的基因多态性位点技术领域本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种用于检测类孟买血型的基因多态性位点。背景技术ABO、H、Lewis等血型抗原均位于红细胞膜外的寡糖支链分子结构上，其中H糖链是形成ABO和Lewis支链的前体物质，它的基本结构是Fuc-GaI-GINAc-Gal-Gal-R寡糖链，并通过酰基神经鞘氨醇连接在红细胞膜表面。如果在这个寡糖链末端连接N-乙酰半乳糖胺基或D-半乳糖基，则分别形成A和B抗原。H抗原是在a-1,2岩藻糖基转移酶的催化下，将供给底物GDP-L-fucose的岩藻糖基转移到接受底物前体糖链上形成的。迄今先后发现2个a-1,2岩藻糖基转移酶编码基因a-1,2fucosyltransferasegenes，FUT1和FUT2，FUT1，或H基因和FUT2或Se基因是两个同源性较高的基因，均编码a1,2岩藻糖基转移酶，可能是由同一个祖先基因经复制进化而来。但2个基因的功能略有不同，其中FUT1，编码的岩藻糖基转移酶负责红细胞系、表皮的上皮细胞、周围神经系统的感觉神经元以及血管内皮细胞等处H抗原的表达，而FUT2编码的岩藻糖基转移酶仅负责内胚层起源的胃肠上皮、唾液及其它外分泌液中H抗原的限制性表达。FUT1和FUT2基因均位于19q13.3的100kb之内，两者间隔35kb，基因方向相同。其中FUT1基因有4个外显子，而蛋白质编码序列均位于第4外显子，糖基转移酶分子由365个氨基酸组成。FUT2基因包含2个外显子，第1外显子在第2外显予上游7kb，所有蛋白质编码序列均位于外显子2中，糖基转移酶分子由332个氨基酸残基组成。1994年Kelly等首先报道了因FUT1基因突变导致H抗原缺陷，发现了3种FUT1无效等位基因，进而导致A和B抗原缺乏。H缺陷型个体可分为孟买型Bombayphenotype和类盂买型para-Bombayphenotype两大类，类孟买型是指在红细胞上不存在ABO和H抗原，但在分泌液中存在ABO和H抗原，即H缺陷的ABO分泌型基因型hhSe-。类孟买型在世界各地均有报道，其中东亚地区发现频率明显高于其他人群，资料表明睁日本人群中类孟买型大约为l～2300000，中国香港为115620，中国台湾大约在18000，中国大陆有较多的类盂买型个例报道，但对其系统研究未见报道。由于类孟买型个体其红细胞上缺乏H抗原，导致血清中产生免疫性抗-H抗体，该抗体能与所有的H抗原阳性献血者红细胞发生严重的溶血性输血反应，在临床输血中很难找到相合血液进行输注。为了解决H缺陷表型个体的临床输血问题，人们对各类H缺陷表型进行分子机制研究。至今报道的遗传性Se-变异等位基因有近30种，包括错义、缺失和插入突变等，大多数个体为纯合子突变引起，极少数为杂合子突变引起。发明内容本发明的目的是提供一种用于检测类孟买血型的基因多态性位点，并提供用于检测该位点的分子标记，可以准确的对红细胞类孟买血型进行检测，从而弥补现有技术的不足。本发明首先提供一种用于检测类孟买血型的基因多态性位点，是FUT1基因编码区域由起始密码子起第749-765位碱基发生缺失；其中第749-765位碱基，其一种碱基序列GGGCACGGCACGAAGCC；本发明的另一个方面提供上述基因多态性位点标记的应用，是在制备检测红细胞类孟买血型的制品中的应用；本发明再一个方面提供一种检测红细胞类孟买血型的制品，所述的制品是用于检测上述的基因多态性位点；其中检测上述的基因多态性位点，是通过能扩增上述基因多态性位点标记的引物对待检测的血样DNA进行PCR扩增，扩增产物进行测序后进行基因型分析，确定待检样品是否存在上述的基因多态性位点标记。上述方法中所使用的引物对，根据实施例的优选，其引物的序列信息如下：FUT1-4F:5’-CCCCAGGAGTCTAAACCTTTAACTT-3’SEQIDNO:1FUT1-4R:5’-CGTCCCCCTTCTCTCCAACT-3’SEQIDNO:2。其中SEQIDNO：2可以作为测序引物来使用。本发明通过检测筛选获得的基因多态性位点，从而提供了一种有效的进行类孟买血型基因诊断途径，应用效果表明本发明所提供的基因多态性位点及检测引物可以有效的用于临床患者进行类孟买血型基因的快速检测。附图说明图1：实施例1的类孟买血型FUT1测序图为先证者，类孟买血型表型。先证者FUT1基因编码区域由起始密码子起第749-765位碱基GGGCACGGCACGAAGCC缺失。图2：等位基因nt749-nt765缺失图。具体实施方式申请人对1例血型血清学检测结果疑似类孟买表型的临床患者FUT1基因测序，发现了一例新的基因多态性位点导致类孟买血型，从而促成了本发明。FUT1基因位于染色体19q13.3区域，可转录成1095bp的mRNANCBI登录号为NG_007510.1，最终翻译形成365个氨基酸组成的蛋白质。由于类孟买型个体其红细胞上缺乏H抗原，导致血清中产生免疫性抗-H抗体，该抗体能与所有的H抗原阳性献血者红细胞发生严重的溶血性输血反应，在临床输血中很难找到相合血液进行输注。因此采用分子生物学的手段，建立类孟买血型基因检测系统，并应用于临床和采供血工作当中，有助于类孟买血型个体的准确检出，帮助患者尽早自体备血和储血以克服输血困难，并有助于降低免疫性溶血性输血反应的发生。对于本发明所涉及等位基因多态性位点标记，申请人解释如下：基因多态性是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型genotype或等位基因allele，亦称遗传多态性geneticpolymorphism或多态性。基因多态性的碱基的取代、缺失、插入引编码序列的核苷酸顺序改变，在转录和翻译合成蛋白质的过程中，造成遗传密码的改变、蛋白质肽链中的片段缺失、mRNA剪接异常、或启动子的突变及非转录区的突变等。有的使基因的转录水平或活性的增强或降低、对多肽链中氨基酸的排列顺序产生影响。下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。实施例1：基因多态性位点标记的筛选1、提取外周血基因组DNA：在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取；疑似类孟买血型患者外周静脉血2-5mL，放入EDTA抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μL放于离心管，加入等体积TEpH8.0，混匀，4℃，10000rpm离心10分钟，弃上清。加入180μLTE、20μLSDS10％、8μL蛋白酶Kl0mgml混匀，置于37℃水浴过夜。从水浴中取出样品，瞬时离心沉淀样本。在反应管中加入等体积的Tris-饱和酚约300μL，充分混匀，室温下10000rpm离心10分钟，吸取上清液约300μL至一新离心管中。重复酚抽提一次，吸取上清液至一新离心管中。加入等体积的Tris饱和酚:氯仿混合液酚、氯仿各150μL，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。加入等体积的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇混合液酚、氯仿、异戊醇各100μL，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。加入l10体积3molL、pH5.2醋酸钠约30μL，2倍体积预冷100％乙醇，轻轻混合，可见白色絮状沉淀。室温10000rpm离心10分钟，使DNA沉淀于管底，弃上清。向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室温7000rpm离心5分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μLTEpH8.0，4℃过夜溶解DNA。对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA纯度及浓度。2、直接测序法寻找该献血员RHD基因的突变PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：1PCR反应条件：95℃5m；95℃30s，58℃30s，72℃60s，35cycles；72℃5m。2反应体系：Onelambda公司FaststartTaqpolymerase应用该反应体系进行先证者的基因组DNA模板与该FUT1引物的扩增反应。PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，FUT1-4R:5’-CGTCCCCCTTCTCTCCAACT-3’，在先证者FUT1基因第四外显子处发现一处突变，为17个碱基片段的缺失图1；进而对FUT1基因第四外显子克隆测序，结果显示一个等位基因nt896AC，另一个等位基因：nt749-nt765delGGGCACGGCACGAAGCC图2。等位基因nt896AC第896位碱基A突变为C，从而导致nt895-897由CAG突变为CCG,氨基酸密码子由谷氨酰胺Gln变为脯氨酸Pro，造成a1,2岩藻糖基转移酶蛋白构象改变，引起H抗原的弱表达。等位基因nt749-nt765delGGGCACGGCACGAAGCC，17个碱基缺失导致氨基酸密码子开放阅读框移位，263位氨基酸变为终止密码子TAA，此无活性的截短的编码蛋白可造成红细胞上ABO血型前体物质H抗原的缺乏。先证者的两个突变的FUT1等位基因是先证者显现类孟买血型的分子基础。多次测序结果表明此多态性基因并不是因为扩增或测序错误引进的，应为一新生突变。该突变不存在于下面的四个数据库中：单核苷酸多态性数据库ftp:ftp.ncbi.nih.govsnpdatabase，千人基因组计划ftp:ftp-trace.ncbi.nih.gov1000genomesftp，Hapmap8数据库http:hapmap.ncbi.nlm.nih.gov，及炎黄数据库http:yh.genomics.org.cn，表明该突变非常罕见，该突变导致了先证者a1,2岩藻糖基转移酶的失活，从而类孟买血型。通过上述的分析，证明通过检测该突变位点可以准确测定特定类孟买基因，从而可以更加精准的确定待测者的血型，对于患者制定输血政策具有重要意义。在青岛市中心血站输血医学研究所收集的先证者家系成员，提取他们的外周血基因组DNA，应用上述DNA作为模板与FUT1-4F和FUT1-4R引物进行PCR目的片段的扩增，常规Sanger测序法应用上述这对引物对PCR产物进行直接测序，发现该先证者的一名家系成员的H血型FUT1基因Exon4中存在本发明中发现的基因缺失突变，即nt749-nt765delGGGCACGGCACGAAGCC，17个碱基缺失。继续对发现该缺失突变的家系成员进行FUT1基因第4外显子的单倍型测序，应用上述提取的两名家系成员的基因组DNA作为模板与FUT1-E4mo、FUT1-E4mo引物进行PCR目的片段的扩增，将PCR产物克隆入T载体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定，单倍型测序引物使用上述引物，确定样本的单倍型序列。单倍型测序发现，该家系成员FUT1基因编码区域nt749-nt765delGGGCACGGCACGAAGCC的17个碱基缺失，导致因开放阅读框移位引起始密码子第263位变为终止密码子TAA，这一截短的蛋白失去了a1,2岩藻糖基转移酶蛋白的活性，与先证者完全一致。序列表青岛市中心血站一种用于检测类孟买血型的基因多态性位点2SIPOSequenceListing1.0125DNA人工序列ArtificialSequence1ccccaggagtctaaacctttaactt25220DNA人工序列ArtificialSequence2cgtcccccttctctccaact20

权利要求：1.一种用于检测类孟买血型的基因多态性位点，其特征在于，所述的多态性位点是FUT1基因编码区域由起始密码子起第749-765位碱基发生缺失；其中第749-765位碱基的序列为GGGCACGGCACGAAGCC。2.权利要求1所述的基因多态性位点在制备检测红细胞类孟买血型的制品中的应用。3.一种检测红细胞类孟买血型的制品，其特征在于，所述的制品是用于检测权利要求1所述的基因多态性位点。4.如权利要求4所述的制品，其特征在于，所述的检测基因多态性位点，是引物对待检测的血样DNA进行PCR扩增，扩增产物进行测序后进行基因型分析，确定待检样品是否存在权利要求1所述的基因多态性位点。5.如权利要求4所述的制品，其特征在于，所述的引物对的序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。

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