买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：中国医学科学院药物研究所

摘要：本发明公开了一种构建抗肥胖药物靶点UCP1的基因工程细胞株的方法，同时公开了抗肥胖药物高通量筛选模型的建立及应用。主要涉及利用CRISPRCas9系统，设计两条独特的sgRNA，在细胞的UCP1基因N端ATG之后敲入luciferase‑T2A‑tdTomato‑WPRE‑pA，特别是将luciferase和tdTomato敲入永生化棕色脂肪细胞UCP1的基因位点，形成首株在UCP1启动子区域插入luciferase和tdTomato的稳转棕色脂肪细胞株，并将其应用于抗肥胖药物的高通量筛选、抗肥胖药物的评价、机体抗肥胖活性物质的评价以及UCP1检测试剂盒的开发。UCP1是特异性表达于棕色脂肪组织的解偶联蛋白，抵抗肥胖的新靶点，该稳转基因工程细胞株的构建对于应用报告基因和高内涵方法，灵敏、准确、高效地对化合物库进行高通量筛选，获得促进产热、降低体重的抗肥胖药物意义重大。

主权项：1.一种利用CRISPR-Cas9系统构建UCP1启动子区域敲入荧光素酶luciferase和红色荧光蛋白tdTomato稳转细胞株的方法，其特征在于，所述方法为：1确定打靶策略，在分析靶基因UCP1基因结构后，设计在UCP1基因N端ATG之后敲入luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA-loxP-Neo-loxP,替换exon1和部分intron1；2靶序列的测序确认，设计靶位点测序引物，对靶细胞系的靶位点序列进行PCR扩增并测序验证，以保证sgRNA识别序列与靶细胞系DNA序列完全一致；3Cas9sgRNA设计，基于sgRNA的设计原则，在5’端和3’端靶位点区域各设计5条sgRNA；4Cas9sgRNA质粒的构建，按照已设计sgRNA序列合成相应引物，通过GibsonAssembly的方式连入pCS-3G载体，连接产物转化后送样测序验证正确；5Cas9sgRNA的活性检测，综合考虑活性、特异性因素选择UCP1-sgRNA1和UCP1-sgRNA6进行下一步实验；6重组外源基因载体构建，合成LR-A片段，设计引物克隆RR片段，并将LR-A片段及RR片段与载体LScKO-4G连接为重组外源基因载体UCP1-LScKO-4G-Neo-LR-A-RR，经过酶切鉴定和测序，确认重组外源基因载体构建完成；7阳性克隆筛选，UCP1-sgRNA1、UCP1-sgRNA6和重组外源基因载体转染靶细胞系，经过G418药物抗性筛选、细胞富集、PCR筛选，得到阳性克隆；所述靶细胞系为永生化棕色脂肪细胞系；所述外源基因为luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA基因；所述的sgRNA对应的靶向序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示；所述的UCP1-sgRNA1序列如SEQIDNO.13所示、UCP1-sgRNA2序列如SEQIDNO.14所示、UCP1-sgRNA3序列如SEQIDNO.15所示、UCP1-sgRNA4序列如SEQIDNO.16所示、UCP1-sgRNA5序列如SEQIDNO.17所示、UCP1-sgRNA6序列如SEQIDNO.18所示、UCP1-sgRNA7序列如SEQIDNO.19所示、UCP1-sgRNA8序列如SEQIDNO.20所示、UCP1-sgRNA9序列如SEQIDNO.21所示、UCP1-sgRNA10序列如SEQIDNO.22所示；选择使用的sgRNA为UCP1-sgRNA1和UCP1-sgRNA6，序列如SEQIDNO.13和SEQIDNO.18所示，pCS-sgRNA1与pCS-sgRNA6核苷酸序列如SEQIDNO.23与SEQIDNO.24所示；外源基因RR片段的克隆引物序列如SEQIDNO.25与SEQIDNO.26所示，重组外源基因载体核苷酸序列如SEQIDNO.27所示。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中国医学科学院药物研究所 抗肥胖药物靶点UCP1的基因工程细胞株和高通量药物筛选模型的建立及应用