买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：艾科迪科尔生物技术公司;巴黎西岱大学;巴黎第十三大学;国家健康与医学研究院;巴黎-萨克雷大学

摘要：本发明涉及人源化抗人GPVI抗体及其用途。

主权项：1.一种与人糖蛋白VIhGPVI结合的分离的人源化抗体或其抗体片段，其中所述抗体或其抗体片段的重链可变区的氨基酸序列包含SEQIDNO:7，并且所述抗体或其抗体片段的轻链可变区的氨基酸序列包含SEQIDNO:8或SEQIDNO:9。

全文数据：新型抗人GPVI抗体及其用途发明领域[0001]本发明涉及新型抗人糖蛋白VI抗体以及其用于治疗心血管疾病的用途。[0002]发明背景[0003]急性冠状动脉和脑血管意外是目前世界上的主要死亡原因。此外，在急性冠状动脉综合征后的治疗后6个月周期中复发和死亡的全球发生率仍为8-15%。[0004]在具有ST段抬高的急性冠状动脉综合征的情况中，采用冠状动脉血管成形术和引入支架的机械治疗对于紧急恢复冠状动脉血流是高度有效的，但不能防止在接下来的6个月内约15%患者的发病率死亡率。基于长期纤维蛋白溶解药物、抗凝药物和抗聚集药物联合的溶栓治疗给出甚至不太令人欣喜的结果。事实上，尽管血栓症的医学治疗有所改善，但6个月时的发病率死亡率相似于无ST段抬高的急性冠状动脉综合征的观察结果。[0005]对于脑血管缺血事件，由于对大多数患者整体晚的医护以及目前可用的抗血栓症治疗的出血风险，治疗仍是非常有限的。[0006]因此临床上仍然需要改善对心血管疾病的治疗，特别是对于与现有分子相比具有改善特征的新分子。面临的挑战是获得对病理性血栓症具有优异功效但没有出血风险的分子。[0007]为了解决这种要求，靶标在患病血管中发生的血栓形成中必须发挥比在为限制健康血管出血所需的生理止血中更大的作用。血小板糖蛋白VI就是这种情况，已经证实其在动物的实验性血栓形成包括中风、血管重塑）中起作用并且证实其在动脉粥样硬化血栓形成中至关重要。[0008]与目前在血栓形成治疗中使用的并抑制血小板最终活化阶段（即血小板聚集）的αIIb03整合素拮抗剂以及血小板募集拮抗剂Ρ2Υ12ADP受体和阿司匹林的抑制剂）相反，GPVI牵涉到血小板栓形成的几个步骤:通过与受损血管壁相互作用的引发;通过初始血小板活化导致次级激动剂secondaryagonists的分泌、整合素和血小板促凝血活性的激活的扩张;经由与纤维蛋白相互作用的生长和稳定Mammadovaetal.，Blood2015。因此，GPVI拮抗剂不仅可以防止血小板聚集，还可以防止次级激动剂释放以及生长因子和细胞因子分泌，从而导致出现血管损害。最后，GPVI表达被限制于血小板和巨核细胞，并因此代表了抗血栓形成治疗的完美特异性靶标。[0009]GPVI拮抗剂因此被开发用于治疗心血管疾病。[0010]WO2001000810和WO2003008454均描述了可溶性GPVI重组蛋白，其是GPVI胞外结构域和人IgFc结构域之间的融合蛋白。这种可溶性重组GPVI蛋白与血小板GPVI竞争结合胶原蛋白。这种可溶性GPVI蛋白首先在血栓形成鼠模型中获得了令人欣喜的结果，但是这些结果未被证实。此外，这种方法涉及结构、功能和药理学缺点。首先，这种化合物是高分子量嵌合蛋白（〜160kDaAPVI-Fc靶向在血管损伤部位暴露的胶原蛋白，其量和可接近性是难以预测的，因此，待注射的产品的量对GPVI-Fc的使用构成潜在的限制。另一个限制可能是对在融合蛋白上可能暴露的新表位免疫的风险。[0011]本领域还描述了针对人GPVI的中和性单克隆抗体。[0012]例如，EP1224942和EP1228768公开了特异性结合小鼠GPVI的大鼠单克隆抗GPVI抗体JAQl，用于治疗血栓性疾病。JAQl抗体诱导小鼠血小板上的GPVI受体不可逆内化。[0013]EP1538165描述了另一种大鼠单克隆抗GPVI抗体hGP5C4，发现其Fab片段对由胶原蛋白刺激诱导的血小板的主要生理功能具有明显的抑制作用:对胶原蛋白介导的生理活化标记物PAC-I和⑶62P-选择素的刺激被hGP5C4Fab完全阻止，并且hGP5C4Fab离体时有效抑制人血小板聚集而没有任何内在活性。然而，5C4是一种大鼠抗体，因此仅具有非常有限的治疗潜力。[0014]WO2005111083描述了4种小鼠单克隆抗GPVI抗体OMl、0M2、0M3和0M4,发现它们在体外抑制GPVI与胶原蛋白的结合、胶原蛋白诱导的分泌和血栓素A2TXA2的形成，以及静脉内注射到食蟹猴后离体时胶原蛋白诱导的血小板聚集。0M4还可以在大鼠血栓形成模型中抑制血栓形成。[0015]WO2001000810还描述了命名为8M14.3、3F8.1、9E18.3、3J24·2、6Ε12·3、IPlO.2、4L7.3、7H4.6、9012.2、7H14.1和9E18.2的各种鼠单克隆抗GPVI抗体以及命名为A9、A10、C9、八4工10、84、03和011的几种人源噬菌体抗体8〇?¥片段。发现这些抗体和8〇?¥片段中的一些抑制GPVI与胶原蛋白的结合，包括抗体8M14.3、3F8.1、9E18.3、3J24.2、6E12.3、1P10.2、礼7.3、7財.6和9012.2以及8〇?¥片段410^4、：10、84、03和011。此外，发现9012.2?313片段完全阻断胶原蛋白诱导的血小板聚集和分泌，阻断纤维蛋白诱导的血小板聚集，抑制胶原蛋白刺激的或纤维蛋白刺激的血小板的促凝血活性以及在静态条件下血小板与胶原蛋白或纤维蛋白的粘附，在动脉血流条件下损害血小板粘附和防止血栓形成。[0016]WO2008049928描述了衍生自9012.2的scFv片段，其由（Gly4Ser3肽连接的9012.2单克隆抗体的VH和VL结构域构成。[0017]然而，目前已知的抗GPVI抗体均没有显示在体内有效用于预防和或治疗心血管疾病。具体而言，已报道的大多数抗GPVI抗体似乎不适合用于开发人类医学用途的抗血栓剂，尤其是由于其动物来源。[0018]具体而言，已报道一些针对人GPVI的人源噬菌体抗体scFvs是抑制性的，但其亲和力似乎较低。此外，血小板表面上GPVI被二价或多价配体如9012.2全IgG交联导致血小板经由GPVI二聚化以及经由GPVI与低亲和力Fc受体FeγRIIA交联而活化。相比之下，单价的9012.2Fab和scFv片段是抑制性的。[0019]然而，这些片段不能用于治疗，因为它们的大小和它们的动物来源使得它们在人类患者中具有免疫原性。而且，scFv片段呈现短的半衰期，这限制了它们的治疗潜力。[0020]因此仍然需要在人体中无免疫原性的中和性GPVI拮抗剂。[0021]US20060088531描述了人scFv片段10B12,其与人GPVI结合的Kd为约7·9·10_7M。Smethurstetal.，2004进一步描述了在人GPVI的Ig样C2型结构域IDl上被10B12结合的表位。这一表位包含人GPVI的残基R58、K61、R66、K79和R80基于UniProtKB登录号Q9HCN6编号。[0022]0’Connoretal.，2006还描述了对GPVI具有低亲和力（5.4IT7M的人scFv片段1C3,其既不阻断胶原蛋白诱导的血小板聚集，也不阻断GPVI与胶原蛋白的结合，但其增强了10B12抗体的抑制作用。GPVI中的1C3表位包含氨基酸1168,并且进一步推测这一表位可能包括残基S164和S182之间的区域，该区域是从小鼠到人类均高度保守的区域。[0023]因此，需要与现有技术的拮抗剂相比具有改善的亲和力、功效和半衰期的人源化抗体g卩，在人体内无免疫原性的抗体），作为有效且充分预防和或治疗人心血管疾病的手段。而且，这些拮抗剂应当优选是易于纯化的。[0024]在本领域中，描述了诱导GPVI耗竭表型的抗GPVI抗体WO2006118350、W02011073954、EP2363416。具体而言，WO2006118350公开了针对所有哺乳动物的抗GPVI抗体。描述了这一抗体结合的GPVI的表位，其对应于GPVI的Ig样C2型结构域2的环9和11，分别对应于氨基酸残基136-142和158-162。[0025]然而，GPVI耗竭是不期望的，因为它不能被控制，并且是不可逆的（即由于巨核细胞上的GPVI耗竭，它持续血小板的寿命，或甚至更长时间）。[0026]在治疗中，需要快速且安全的抗血小板作用。因此，应当开发不诱导GPVI耗竭表型并且优选不诱导体内血小板计数降低（即具有可逆效应的抗体。[0027]申请人开发了与一种新型的、无记载的构象表位结合的抗GPVI抗体。所述抗GPVI抗体对人GPVI具有强亲和力，并且阻断GPVI与其配体包括胶原蛋白和纤维蛋白）的相互作用，而不会降低体内血小板计数，也不会耗竭体内GPVI。因此，本发明涉及改进的对人GPVI具有特异性的人源化中和性抗体。发明内容[0028]本发明涉及一种与人糖蛋白VIhGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中所述蛋白质与构象表位结合，所述构象表位包含：[0029]-来自hGPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至142的至少一个氨基酸残基或来自相对于hGPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至142具有至少60%同一性的序列的至少一个氨基酸残基;和[0030]-来自hGPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187的至少一个氨基酸残基或来自相对于hGPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187具有至少60%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。[0031]在一个实施方案中，本发明的分离的人源化蛋白质所结合的构象表位包含来自hGPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135的至少一个氨基酸残基或来自相对于hGPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135具有至少60%同一性的序列的至少一个氨基酸残基;和来自hGPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至183的至少一个氨基酸残基或来自相对于hGPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至183具有至少60%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。[0032]本发明还涉及一种与人糖蛋白VIhGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中所述蛋白质与hGPVI结合的Kd小于15nM，其中所述Kd通过表面等离子体共振法使用960至1071RU的可溶性人GPVI以及使用PBSpH7.4作为运行缓冲液来测量。在一个实施方案中，本发明的分离的人源化蛋白质在体内不诱导GPVI耗竭表型。[0033]在一个实施方案中，本发明的蛋白质是选自由全抗体、人源化抗体、单链抗体、Fv、Fab组成的组的抗体分子;或选自由单抗体unibody、域抗体domainantibody和纳米抗体（nanobody组成的组的抗体片段；或选自由亲和体（affibody、affilin、affitin、adnectin、atrimer、evasin、DARPin、anticalin、avimer、fynomer^Pversabod}^iij^9^Ji^单体抗体模拟物。[0034]在一个实施方案中，本发明的抗体是单价的。[0035]在一个实施方案中，重链的可变区包含以下⑶R中的至少一个：[0036]VH-CDRl:GYTFTSYNMHSEQIDNO:1;[0037]VH-CDR2:GIYPGNGDTSYNQKFQGSEQIDNO:2;和[0038]VH-CDR3:GTWGDWYFDVSEQIDN0:3，[0039]或具有与SEQIDNO:1-3具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何CDR。[0040]在一个实施方案中，轻链的可变区包含以下⑶R中的至少一个：[0041]VL-CDR1:RSSQSLENSNGNTYLNSEQIDN0:4;[0042]VL-CDR2:RVSNRFSSEQIDNO:5;和[0043]VL-CDR3:LQLTHVPWTSEQIDN0:6，[0044]或具有与SEQIDNO:4-6具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。[0045]在一个实施方案中，重链的可变区包含如上文所定义的⑶R中的至少一个，并且轻链的可变区包含如上文所定义的⑶R中的至少一个。[0046]在一个实施方案中，重链的可变区包含以下CDR:GYTFTSY匪HSEQIDN0:1、GΠPGNGDTSYNQKFQGSEQIDN0:2和GTVVGDWYFDVSEQIDN0:3，并且轻链的可变区包含以下CDR:RSSQSLENSNGNTYLNSEQIDN0:4、RVSNRFSSEQIDN0:5和LQLTHVPWFSEQIDN0:6，或具有与所述SEQIDN0:l-6具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何CDR。[0047]在一个实施方案中，编码重链可变区的氨基酸序列是SEQIDN0:7,编码轻链可变区的氨基酸序列是SEQIDN0:8,或具有与所述SEQIDN0:7或8具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何序列。[0048]在一个实施方案中，编码重链可变区的氨基酸序列是SEQIDN0:7,编码轻链可变区的氨基酸序列是SEQIDN0:9,或具有与所述SEQIDN0:7或9具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何序列。[0049]本发明进一步涉及一种组合物，其包含如上文所定义的与人GPVI结合的蛋白质。[0050]本发明进一步涉及一种药物组合物，其包含如上文所定义的与人GPVI结合的蛋白质和至少一种药学上可接受的赋形剂。[0051]在一个实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗GPVI有关状况或在其中的用途。[0052]在一个实施方案中，所述GPVI有关状况是选自动脉和静脉血栓形成、再狭窄、急性冠状动脉综合征和缺血性脑血管意外的心血管疾病。[0053]本发明还涉及本发明的抗人GPVI的抗体用于检测生物样品中的GPVI的用途。[0054]本发明的另一个目的是一种表达载体，其包含SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12中的至少一个或具有与所述SEQIDNO:10-12具有至少60%同一性的核酸序列的任何序列。[0055]发明详述[0056]“糖蛋白VIGPVI”是参与血小板-胶原蛋白相互作用的血小板膜糖蛋白。GPVI是在血小板表面上表达的跨膜胶原蛋白受体。在一个实施方案中，人GPVI的氨基酸序列是SEQIDN0:13登录号：BAA89353.1或与SEQIDN0:13呈现至少约90%同一性、优选与SEQIDNO:13具有至少约91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性的任何氨基酸序列。[0057]SEQIDN0：13[0058]MSPSPTALFCLGLCLGRVPA信号肽）[0059]QSGPLPKPSLQALPSSLVPLEKPVTLRCQGPPGVDLYRLEKLSSSRYQDQAVLFIPAMKRSLAGRYRCSYQNGSLWSLPSDQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSSGGDVTLQCQTRYGFDQFALYKE⑶PAPYKNPERWYRASFPIITVTAAHSGTYRCYSFSSRDPYLWSAPSDPLELVVTGTSVTPSRLPTEPPSSVAEFSEATAELTVSFTNKVFTTETSRSITTSPKESDSPAGPARQYYTKGN胞外结构域）[0060]LVRICLGAVILIILAGFLAEDWHSRRKRLRHRGRAVQRPLPPLPPLPQTRKSHGGQDGGRQDVHSRGLCS跨膜和胞浆结构域）[0061]GPVI的胞外结构域包含通过域间铰链连接的两个Ig样C2型结构域（S卩Dl和D2。在一个实施方案中，Dl包含SEQIDNO:13的氨基酸残基21至109。在一个实施方案中，Dl和D2之间的域间铰链包含SEQIDNO:13的氨基酸残基110至113。在一个实施方案中，D2包含SEQIDNO:13的氨基酸残基114至207。[0062]数字前面的“约”意指所述数字的加上或少于10%的值。[0063]“抗体”或“免疫球蛋白”-如本文所用，术语“免疫球蛋白”包括具有两个重链和两个轻链的组合的蛋白质，而无论其是否具有任何相关的特异免疫反应性。“抗体”是指对感兴趣的抗原例如人GPVI具有显著的已知特异免疫反应活性的装配体。术语“抗GPVI抗体”在本文中是指对人GPVI蛋白表现出免疫特异性的抗体。如本文其他地方所解释的，针对人GPVI的“特异性”不排除与GPVI的种同源物的交叉反应。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，它们之间具有或不具有链间共价连接。脊椎动物系统中的基础免疫球蛋白结构已经相对得到深入了解。上位术语“免疫球蛋白”包括在生化上可以区分的五种不同类型的抗体。所有五类抗体都在本发明的范围内；以下讨论一般是针对IgG类免疫球蛋白分子进行的。关于IgG，免疫球蛋白包含分子量为约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽链和分子量为约53,000-70，000道尔顿的两条相同的重链。四条链通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”的口开始并持续穿过可变区而括上重链。抗体的轻链被分类为κ或λ[κ]，[λ]。每个重链类可以与κ或λ轻链结合。一般而言，当免疫球蛋白由杂交瘤细胞B细胞或基因工程宿主细胞产生时，轻链和重链彼此共价结合，并且两条重链的“尾部”区域通过共价二硫键或非共价键彼此结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉末端的N末端运行至每条链底部的C末端。本领域技术人员理解，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其中具有一些亚类例如γ1-γ4。这条链的性质决定了抗体的“类型”分别为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亚类（同种型例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl等被充分表征，并且已知赋予功能特化。鉴于本发明的公开内容，这些类型和同种型中的每一种的修改版本对于本领域技术人员是容易辨别的，并且因此在本发明的范围内。如上所述，抗体的可变区允许抗体选择性地识别和特异性地结合抗原上的表位。即，抗体的轻链可变结构域VL结构域和重链可变结构域VH结构域）组合以形成界定三维抗原结合位点的可变区。这种四级抗体结构形成在“Y”的每个臂末端存在的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由每条VH和VL链上的三个互补决定区CDR限定。[0064]“分离的抗体本文所用，“分离的抗体”是已从其天然环境的组分中分离和或回收的抗体。其天然环境的污染性组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可能包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质组分。在优选的实施方案中，将抗体纯化至：（1如通过Lowry法测定的，大于抗体的80、85、90、91、92、93、94、95重量％或更多，并且最优选大于99重量％;2通过使用旋杯式序列分析仪足以获得至少15个残基的N末端或内部氨基酸序列的程度;或（3如在还原性或非还原性条件下使用考马斯蓝或优选银染色通过SDS-PAGE显示均质。因为抗体天然环境的至少一种组分将不存在，分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，通常通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。[0065]“亲和力变体如本文所用，术语“亲和力变体”是指与参考抗GPVI抗体相比表现出氨基酸序列的一个或多个变化的变体抗体，其中亲和力变体与参考抗体相比表现出对人GPVI蛋白的亲和力的改变。通常，与参考抗GPVI抗体相比，亲和力变体将表现出改善的对人GPVI的亲和力。这种改善可以是对人GPVI的Kd更低，对人GPVI的Ka更高，对人GPVI的结合速率on-rate更快或对人GPVI的解离速率off-rate更慢，或者与非人GPVI同源物的交叉反应性模式改变。与参考抗GPVI抗体相比，亲和力变体通常表现出在CDR中氨基酸序列的一个或多个变化。这样的取代可能导致用不同的氨基酸残基置换在CDR中给定位置存在的原始氨基酸，所述不同的氨基酸残基可以是天然存在的氨基酸残基或非天然存在的氨基酸残基。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。[0066]“结合位点如本文所用，术语“结合位点”包含负责选择性地结合感兴趣的靶抗原（例如人GPVI的蛋白质的区域。结合结构域或结合区包含至少一个结合位点。示例性结合结构域包括抗体可变结构域。本发明的蛋白质可以包含单个抗原结合位点或多个例如两个、三个或四个抗原结合位点。然而，优选地，本发明的蛋白质包含单个抗原结合位点。[0067]“保守氨基酸取代如本文所用，“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链例如天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、β支链侧链例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和芳族侧链例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基置换。在另一个实施方案中，一串氨基酸可以用侧链家族成员的顺序和或组成不同的结构相似的氨基酸串置换。[0068]“嵌合如本文所用，“嵌合”蛋白质包含与本质上不是天然连接的第二氨基酸序列连接的第一氨基酸序列。所述氨基酸序列通常可以存在于在融合蛋白中将其聚在一起的独立的蛋白质中，或者它们通常可以存在于同一的蛋白质中但以新的排列方式置于融合蛋白质中。嵌合蛋白质可以例如通过化学合成或通过产生并翻译其中肽区以期望的关系编码的多核苷酸来产生。[0069]“⑶R”_如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”意指在重链和轻链多肽的可变区内都发现的非连续抗原结合位点。根据由Kabatetal.1991和Chotia和Lesk1987推导的以下规则来鉴定⑶R:[0070]-CDR-Ll:[0071]开始-大约残基24[0072]之前的残基总是Cys[0073]之后的残基总是Trp。通常为TRP-TYR-GLN，但还可以是TRP-LEU-GLN、TRP-PHE-GLN、TRP-TYR-LEU[0074]长度为10至17个残基[0075]-CDR-L2:[0076]开始-在Ll结束之后总是16个残基[0077]之前的残基一般为ILE-TYR，还可以是VAL-TYR、ILE-LYS、ILE-PHE[0078]长度总是为7个残基。[0079]-CDR-L3:[0080]开始-在L2结束之后总是33个残基[0081]之前的残基总是Cys[0082]之后的残基总是PHE-GLY-XXX-GLYSEQIDN0:21[0083]长度为7至11个残基[0084]-CDR-Hl:[0085]开始-大约残基26在CYS之后总是4个）[ChothiaAbM定义]Kabat定义以更后面的5个残基开始[0086]之前的残基总是CYS-XXX-XXX-XXXSEQIDN0:22[0087]之后的残基总是TRP。通常为TRP-VAL，还可以是TRP-1LE、TRP-ALA[0088]长度为10至12个残基AbM定义Chothia定义排除最后4个残基[0089]-CDR-H2:[0090]开始-在CDR-Hl结束KabatAbM定义之后总是15个残基[0091]之前的残基通常为LEU-GLU-TRP-ILE-GLYSEQIDN0:23，但有一些变化[0092]之后的残基为LYSARG-LEUILEVALPHETHRALA-THRSERILEALA[0093]长度Kabat定义为16至19个氨基酸AbM定义以更早的7个残基结束）[0094]-CDR-H3:[0095]开始-在⑶R-H2结束后总是33个残基在CYS之后总是2个）[0096]之前的残基总是CYS-XXX-XXX通常为CYS-ALA-ARG[0097]之后的残基总是TRP-GLY-XXX-GLYSEQIDN0:24[0098]长度为3至25个残基[0099]“CH2结构域如本文所用，术语“CH2结构域”包括通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340的重链分子的区域。CH2结构域是独特的，因为它不与另一个结构域紧密配对。相反，两个N-连接的支链碳水化合物链插入在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测，碳水化合物可以提供结构域-结构域配对的替代物，并帮助稳定CH2结构域Burton，Molec.Immunol·221985161-206。[0100]“来源于如本文所用，术语“来源于”指定的蛋白质例如抗GPVI抗体或其抗原结合片段是指蛋白质的来源。在一个实施方案中，来源于特定起始蛋白质的蛋白质或氨基酸序列是CDR序列或与其相关的序列。在一个实施方案中，来源于特定起始蛋白质的氣基酸序列是不连续的。例如，在一个实施方案中，一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR来源于起始抗体。在一个实施方案中，来源于特定起始蛋白质或氨基酸序列的蛋白质或氨基酸序列具有与起始序列或其区域基本上相同的氨基酸序列，其中该区域由至少3-5个氨基酸、至少5-10个氨基酸、至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸或至少30-50个氨基酸组成，或者在起始序列中具有其起始点origin而使本领域普通技术人员可以其他方式识别的氨基酸序列。在一个实施方案中，改变来源于起始抗体的一个或多个CDR序列以产生变体CDR序列，例如亲和力变体，其中变体CDR序列保持GPVI结合活性。[0101]“双抗体如本文所用，术语“双抗体”是指通过在VH和VL结构域之间用短连接体约5-10个残基构建sFv片段参见sFv段落制备的小抗体片段，从而实现V结构域的链间而不是链内配对，产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中这两种抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更详细地描述在例如以下文献中：EP0404097;W01993011161;和Holligeretal.，Proc·Natl.Acad.Sci·，90:6444-64481993〇[0102]“工程化如本文所用，术语“工程化”包括通过合成手段例如通过重组技术、体外肽合成、通过肽的酶促或化学偶联或这些技术的某些组合处理核酸或多肽分子。优选地，本发明的抗体被工程化，包括例如人源化抗体和或嵌合抗体以及已被工程化以改善一种或多种性质如抗原结合、稳定性半衰期或效应子功能）的抗体。[0103]“表位如本文所用，术语“表位”是指位于抗体结合的一种或多种蛋白质上的氨基酸的特定排列。表位通常由分子如氨基酸或糖侧链的化学活性表面分组组成，并且具有特定的三维结构特性以及特定的电荷特性。表位可以是线性的或构象的，即涉及抗原不同区域中的可能不一定是连续的两个或更多个氨基酸序列。[0104]“框架区如本文所用，术语“框架区”或“FR区”包括作为可变区的一部分但不是⑶R的一部分例如使用⑶R的KabatChothia定义）的氨基酸残基。因此，可变区框架的长度在约100-120个氨基酸之间，但仅包括⑶R之外的那些氨基酸。对于重链可变区的特定实例以及对于KabatChothia定义的⑶R，构架区1可以对应于包含氨基酸1-25的可变区的结构域;框架区2可以对应于包含氨基酸36-49的可变区的结构域;框架区3可以对应于包含氨基酸67-98的可变区的结构域;框架区4可以对应于可变区的从氨基酸110到可变区末端的结构域。轻链的构架区类似地被每个轻链可变区CDR分隔开。在天然存在的抗体中，每个单体抗体上存在的六个CDR是短的、非连续的氨基酸序列，当抗体在含水环境中呈现其三维构型时，这些序列特异定位以形成抗原结合位点。重可变结构域和轻可变结构域的剩余部分的氨基酸序列显示较少的分子间变异性并且被称为框架区。框架区域主要采用折叠构象，并且⑶R形成连接β-折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。因此，这些框架区起到形成支架的作用，该支架通过链间非共价相互作用将六个CDR定位在正确方向上。由定位的CDR形成的抗原结合位点界定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这一互补表面促进抗体与免疫反应性抗原表位的非共价结合。本领域的普通技术人员可以容易地确定⑶R的位置。[0105]“片段如本文所用，术语“片段”是指包含比完整或完全抗体或抗体链更少的氨基酸残基的抗体或抗体链的部分或区域。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的蛋白质片段，其结合抗原或与完整抗体（即其由之衍生的完整抗体）竞争抗原结合（即与人GPVI的特异性结合）。如本文所用，术语抗体分子的“片段”包括抗体的抗原结合片段，例如抗体轻链可变结构域VL、抗体重链可变结构域VH、单链抗体scFv、Fat2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体片段DAb、单臂单价抗体、双抗体或由此类抗原结合片段的结合、组装或缀合形成的任何抗原结合分子。片段可以例如经由化学或酶处理完整或完全抗体或抗体链或通过重组手段来获得。[0106]“Fv”_如本文所用，术语“Fv”是含有完全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这种片段由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。这两个结构域的折叠产生六个高变环H链和L链各自三个环），其有助于抗原结合并赋予抗体结合抗原的特异性。然而，甚至单个可变结构域或仅包含对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。[0107]“重链区如本文所用，术语“重链区”包括来源于免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸序列。包含重链区的蛋白质包含以下结构域的至少一个:CHl结构域、铰链例如，上、中和或下铰链区）结构域、CH2结构域、CH3结构域，或其变体或片段。在一个实施方案中，本发明的结合分子可以包含免疫球蛋白重链的Fc区（例如铰链部分、CH2结构域和CH3结构域）。在另一个实施方案中，本发明的结合分子缺少恒定结构域的至少一个区域例如，CH2结构域的全部或部分）。在某些实施方案中，至少一个并优选全部的恒定结构域来源于人免疫球蛋白重链。例如，在一个优选实施方案中，重链区包含完全人铰链结构域。在其他优选实施方案中，重链区包含完全人Fc区（例如来自人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3结构域序列）。在某些实施方案中，重链区的组成性恒定结构域来自不同的免疫球蛋白分子。例如，蛋白质的重链区可以包含来源于IgG1分子的CH2结构域和来源于IgG3或IgG4分子的铰链区。在其他实施方案中，恒定结构域是包含不同免疫球蛋白分子的区域的嵌合结构域。例如，铰链可以包含来自IgGl分子的第一区域和来自IgG3或IgG4分子的第二区域。如上所述，本领域普通技术人员理解，重链区的恒定结构域可被修饰，使得它们的氨基酸序列不同于天然存在的野生型）免疫球蛋白分子。也就是说，本文公开的本发明的蛋白质可以包含对一个或多个重链恒定结构域CH1、铰链、CH2或CH3和或轻链恒定结构域CL的改变或修饰。示例性修饰包括在一个或多个结构域中添加、缺失或取代一个或多个氨基酸。[0108]“铰链区如本文所用，术语“铰链区”包括将CHl结构域连接至CH2结构域的重链分子的区域。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N末端抗原结合区独立移动。铰链区可以再分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域（Rouxetal.，J.Immunol.1998161:4083。[0109]术语“高变环”和“互补决定区”严格地说并不是同义词，因为高变环HV是基于结构来定义的，而互补决定区（⑶R是基于序列变异性来定义的（Kabatetal.，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD.，1983，并且HV和CDR的限定在一些VH和VL结构域中可能不同。VL和VH结构域的⑶R通常可以根据KabatChothia定义参见上文来定义。在一个实施方案中，VL和VH结构域的CDR可以包含以下氨基酸:轻链可变结构域中的残基24-39CDRLl、55-61CDRL2和94-102CDRL3，以及重链可变结构域中的残基26-35CDRHl、50-66CDRH2和99-109CDRH3。因此，除非另有说明，HV可以包含在相应的CDR内，并且本文提到VH和VL结构域的“高变环”时应当解释为也涵盖相应的CDR，反之亦然。如下文所定义的，可变结构域的较高度保守的区域称为框架区FR。天然重链和轻链的可变结构域各自包含通过三个高变环连接的四个FR分别为FRI、FR2、FR3和FR4，大部分采用β-折叠构型。每条链中的高变环通过FR紧密靠近在一起，并与来自另一条链的高变环一起促成抗体的抗原结合位点的形成。抗体的结构分析揭示了序列与由互补决定区形成的结合位点的形状之间的关系（Chothiaetal.，J.Mol.Biol.227:799_8171992;Tramontanoetal·，J.M〇l.Bi〇l，215:175-1821990。尽管它们具有高度的序列变异性，但六个环中的五个仅采用一小部分主链构象，称为“规范结构”。这些构象首先由环的长度决定，其次由环中和框架区中某些位置上存在的关键残基决定，这些关键残基通过它们的堆积、氢键或呈现不寻常的主链构象来决定构象。[oho]“人源化”-如本文所用，术语“人源化”是指嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段如F^Fabjal或抗体的其他抗原结合子序列），其含有来源于鼠免疫球蛋白的最小序列。例如，人源化抗体是人免疫球蛋白（受体抗体），其中来自受体的互补决定区（CDR的残基被来自初始抗体供体抗体的CDR的残基置换，同时保持期望的原始抗体特异性、亲和力和能力。[0111]“人源化取代”-如本文所用，术语“人源化取代”是指氨基酸取代，其中在非人抗GPVI抗体例如鼠抗GPVI抗体）的VH或VL结构域中的特定位置存在的氨基酸残基被在参考人VH或VL结构域的等同位置出现的氨基酸残基置换。参考人VH或VL结构域可以是由人种系编码的VH或VL结构域，在这种情况下，取代的残基可以被称为“种系取代”。人源化取代种系取代可以在本文定义的抗GPVI抗体的构架区和或CDR中进行。[0112]“高度人同源性如果VH结构域和VL结构域合起来表现出与最接近的匹配人种系VH和VL序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的氨基酸序列同一性，则包含重链可变结构域VH和轻链可变结构域VL的抗体将被认为具有高度人同源性。具有高度人同源性的抗体可以包括包含天然非人抗体的VH和VL结构域的抗体，所述天然非人抗体表现出足够高的百分比序列同一性人种系序列，以及此类抗体的工程化特别是人源化变体以及“完全人”抗体。在一个实施方案中，具有高度人同源性的抗体的VH结构域可以在框架区FRl、FR2、FR3和FR4上显示出与一个或多个人VH结构域75%、80%或更高的氨基酸序列同一性或序列同源性。在其他实施方案中，本发明蛋白质的VH结构域与最接近的匹配人种系VH结构域序列之间的氨基酸序列同一性或序列同源性可以是85%或更高、90%或更高、95%或更高、97%或更高、或高达99%或甚至100%。在一个实施方案中，与最接近的匹配人VH序列相比，具有高度人同源性的抗体的VH结构域可以在框架区FRl、FR2、FR3和FR4上含有一个或多个例如1至20个氨基酸序列错配。在另一个实施方案中，具有高度人同源性的抗体的VL结构域可以在框架区FRl、FR2、FR3和FR4上显示出与一个或多个人VL结构域80%或更高的序列同一性或序列同源性。在其他实施方案中，本发明蛋白质的VL结构域与最接近的匹配人种系VL结构域序列之间的氨基酸序列同一性或序列同源性可以是85%或更高、90%或更尚、95%或更尚、97%或更尚、或尚达99%或甚至100%。[0113]在一个实施方案中，与最接近的匹配人VL序列相比，具有高度人同源性的抗体的VL结构域可以在框架区FR1、FR2、FR3和FR4上含有一个或多个例如1至20个、优选1至10个、更优选1至5个氨基酸序列错配。在分析具有高度人同源性的抗体与人种系VH和VL之间的百分比序列同一性之前，可以确定规范折叠，这允许鉴定对Hl和H2或Ll和L2和L3具有相同的规范折叠组合的人种系片段的家族。随后选择与感兴趣的抗体的可变区具有最高程度序列同源性的人种系家族成员来对序列同源性进行评分。可使用可在网页www.bioinf.org.ukabschothia.html.page上公开获得的生物信息学工具确定高变环1^1、1^丄3、!11和!12的〇1〇也丨规范类型。程序的输出显示数据文件中的关键残基要求。在这些数据文件中，在每个位置处用允许的氨基酸来显示关键残基位置。感兴趣的抗体的可变区的序列作为输入给出，并首先与共有抗体序列比对以分配KabatChothia编号方案。对规范折叠的分析使用由Martin和Thornton开发的一套自动化方法得到的一组关键残基模板Martinetal.，J.Mol.Biol.263:800-8151996。采用已知的特定人种系V区段其使用对Hl和H2或Ll和L2和L3相同的规范折叠组合），就序列同源性而言可以确定最佳匹配家族成员。采用生物信息学工具，可确定感兴趣的抗体的VH和VL结构域框架氨基酸序列与人种系编码的相应序列之间的百分比序列同一性，但实际上也可应用手动比对序列。可以从若干蛋白质数据库鉴定人免疫球蛋白序列，如VBasehttp:vbase·mrc-cpe·cam·ac·uk或PluckthunHonegger数据库（http:www.bioc.unizh.chantibodySequencesGermIines。为了比较人序列与感兴趣的抗体中的VH或VL结构域的V区，可使用序列比对算法，如可经由www.expasy.chtooIs#align网站获得的算法，但也可对有限的序列组进行手动比对。选择具有相同的规范折叠组合并与每条链的构架区1、2和3具有最高同源性程度的家族的人种系轻链和重链序列，并将其与感兴趣的可变区进行比较;还针对人种系JH和JK或JL区检查FR4。注意，在总百分比序列同源性的计算中，使用来自具有相同的规范折叠组合的人种系家族的最接近的匹配序列来评价FR1、FR2和FR3的残基。只有不同于具有相同规范折叠组合的相同家族的最接近的匹配或其他成员的残基才被评分NB-不包括任何引物编码的差异）。然而，出于人源化的目的，与不具有相同的规范折叠组合的其他人种系家族的成员相同的框架区中的残基可以被认为是“人”，尽管事实上根据上述严严谨条件这些残基的评分为“负”。这一假设是基于人源化的“混合和匹配”方法，其中FR1、FR2、FR3和FR4中的每一个分别与其最接近的匹配人种系序列进行比较，因此人源化分子含有不同的FR组合，如Qu和同事们（Quetal.，Clin.CancerRes.5:3095_31001999和Ono和同事们（Onoetal.，Mol.Immunol.36:387-3951999所做的那样。可以使用MGT编号方案来分配各个框架区域的边界，所述MGT编号方案是Chothia编号方案的改编Lefrancetal.,Nucleicacidres27:209-2121999;http:im.gt.cines.fr。具有高度人同源性的抗体可以包含具有人的或类似于人的规范折叠的高变环或CDR，如下文详细讨论的。在一个实施方案中，具有高度人同源性的抗体的VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环或CDR可以从非人抗体的VH或VL结构域获得或衍生，但仍表现出预测的或实际的与人抗体中存在的规范折叠结构基本上相同的规范折叠结构。本领域公认，尽管在由人种系编码的VH结构域和VL结构域中都存在的高变环的一级氨基酸序列根据定义是高度可变的，但除VH结构域的CDRH3之外的所有高变环仅采用几种不同的结构构象，称为规范折叠（Chothiaetal.，J.Mol.Biol.l96:901_9171987;Tramontanoetal.,Proteins6:382-941989，其既取决于高变环的长度也取决于所谓的规范氨基酸残基的存在（Chothiaetal.，J.Mol.Biol.196:901-9171987。可通过结构分析例如X射线晶体学）来确定完整VH或VL结构域中高变环的实际规范结构，但是也可以基于特定结构特征性的关键氨基酸残基来预测规范结构在下文进一步讨论）。实质上，决定每个规范结构的残基的特定模式形成“标记signature”，其使得规范结构在未知结构的VH或VL结构域的高变环中也能够被识别；因此可单独基于一级氨基酸序列来预测规范结构。可使用可从www.bioinf.org.ukabschothia.html、www.biochem.ucl.ac.uk〜martinantibodies.html和www·bioc·unizh·chantibodySequencesGermlinesVbase_hVk·html公开获得的算法来分析对具有高度人同源性的抗体中任何给定的VH或VL序列的高变环预测的规范折叠结构。这些工具允许针对已知规范结构的人VH或VL结构域序列查询待比对的VH或VL序列，并允许预测查询序列的高变环的规范结构。在VH结构域的情况下，如果满足以下标准中的至少第一个、并且优选两个，则Hl和H2环可以被评分为具有与已知在人抗体中存在的规范折叠结构“基本上相同”的规范折叠结构：[0114]1.与最接近的匹配人规范结构类型相同的长度，由残基的数量决定。[0115]2.与对相应的人Hl和H2规范结构类型所描述的关键氨基酸残基具有至少33%的同一性，优选至少50%的同一性注意：为了前述分析的目的，分别对Hl和H2环进行处理并将每个与其最接近的匹配人规范结构类型进行比较）。前述分析依赖于对感兴趣的抗体的Hl和H2环的规范结构的预测。如果感兴趣的抗体中的Hl和H2环的实际结构是已知的，例如基于X射线晶体学，则如果环的长度不同于最接近的匹配人规范结构类型的环的长度通常为+1个或+2个氨基酸），但是感兴趣的抗体中的Hl和H2环的实际结构与人规范折叠的结构相匹配，那么感兴趣的抗体中的Hl和H2环也可以被评分为具有与已知在人抗体中存在的规范折叠结构“基本上相同”的规范折叠结构。Chothiaetal.，J.Mol.Biol.227:799-8171992描述了在人VH结构域HI和H2的第一和第二高变环的人规范结构类型中发现的关键氨基酸残基，该内容以其整体通过引用的方式并入本文。具体而言，Chothia等人的第802页的表3其通过引用的方式明确并入本文列出了在人种系中发现的HI规范结构的关键位点处的优选氨基酸残基，而第803页的表4也通过引用的方式明确并入本文列出了在人类种系中发现的CDRH2规范结构的关键位点处的优选氨基酸残基。在一个实施方案中，具有高度人同源性的抗体的VH结构域中的Hl和H2均表现出与在人抗体中出现的规范折叠结构基本上相同的预测的或实际的规范折叠结构。具有高度人同源性的抗体可以包含VH结构域，其中高变环Hl和H2形成规范折叠结构的组合，该组合与已知在至少一个人种系VH结构域中出现的规范结构的组合相同。已经观察到，仅Hl和H2处的规范折叠结构的某些组合实际上出现在由人种系编码的VH结构域中。在一个实施方案中，具有高度人同源性的抗体的VH结构域中的Hl和H2可以从非人物种的VH结构域获得，但形成预测的或实际的规范折叠结构的组合，该组合与已知在人种系或体细胞突变的VH结构域中存在的规范折叠结构相同。在非限制性实施方案中，具有高度人同源性的抗体的VH结构域中的Hl和H2可以从非人物种的VH结构域获得，并且形成下列规范折叠组合之一：1-1、1-2、1-3、1-6、1-4、2-1、3-1和3-5。具有高度人同源性的抗体可以含有VH结构域，其显示出与人VH的高度序列同一性序列同源性，并且其含有与人VH显示出结构同源性的高变环。在具有高度人同源性的抗体的VH结构域中的Hl和H2存在的规范折叠及其组合，在总体一级氨基酸序列同一性方面对于代表与具有高度人同源性的抗体的VH结构域最接近的匹配的人VH种系序列是“正确”的，这可能是有利的。举例来说，如果与人种系VH3结构域是最接近的序列匹配，则有利于HI和H2形成在人VH3结构域中也是天然存在的规范折叠的组合。这对于来源于非人物种的具有高度人同源性的抗体而言可能尤其重要，例如含有来源于骆驼科动物常规抗体的VH和VL结构域的抗体，特别是含有人源化骆驼科动物VH和VL结构域的抗体。因此，在一个实施方案中，具有高度人同源性的抗GPVI抗体的VH结构域在整个框架区FRl、FR2、FR3和FR4上可以显示出与人VH结构域70%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、97%或更高或高至99%或甚至100%的序列同一性或序列同源性，并且另外，同一抗体中的Hl和H2从非人VH结构域获得，但形成与已知在同一人VH结构域中天然存在的规范折叠组合相同的预测的或实际的规范折叠结构的组合。在其他实施方案中，具有高度人同源性的抗体的VL结构域中的Ll和L2各自从非人物种的VL结构域获得，并且各自显示出与人抗体中存在的规范折叠结构基本上相同的预测或实际的规范折叠结构。如同VH结构域一样，νλ和Vk型的VL结构域的高变环可采用有限数量的构象或规范结构，其部分由长度确定，并且还由某些规范位置处关键氨基酸残基的存在决定。在具有高度人同源性的感兴趣的抗体内，从非人物种例如骆驼科物种）的VL结构域获得的L1、L2和L3环如果满足以下标准的至少第一个、并且优选两个，则可以被评分为具有与已知在人抗体中存在的规范折叠结构“基本上相同”的规范折叠结构：[0116]1.与最接近的匹配人结构类型相同的长度，由残基的数量决定。[0117]2.与对来自νλ或Vk库的相应人Ll或L2规范结构类型所描述的关键氨基酸残基具有至少33%的同一性、优选至少50%同一性注意：为了前述分析的目的，分别对Hl和Η2环进行处理并将每个与其最接近的匹配人规范结构类型进行比较）。前述分析依赖于对感兴趣的抗体的VL结构域中的LI、L2和L3环的规范结构的预测。如果LI、L2和L3环的实际结构是已知的，例如基于X射线晶体学，则如果环的长度不同于最接近的匹配人规范结构类型的环的长度通常为+1个或+2个氨基酸），但是感兴趣的抗体中的环的实际结构与人规范折叠的结构相匹配，那么来源于感兴趣的抗体的L1、L2或L3环也可以被评分为具有与已知在人抗体中存在的规范折叠结构“基本上相同”的规范折叠结构。Moreaetal.，Methods，20:267_2792000和Martinetal.，J.Mol.Biol.,263:800-8151996描述了在人规范结构类型中发现的对人的νλ和Vk结构域的⑶R的关键氨基酸残基。而且Tomlinsonetal.，EMB0J.14:4628-46381995描述了人Vk结构域的结构库，Williamsetal.，J.Mol·Biol.，264:220-2321996描述了νλ结构域的结构库。所有这些文献的内容都通过引用的方式并入本文。具有高度人同源性的抗体的VL结构域中的Ll和L2可以形成与已知在人种系VL结构域中存在的规范折叠结构的组合相同的预测的或实际的规范折叠结构的组合。在非限制性实施方案中，具有高度人同源性的抗体的νλ结构域中的Ll和L2可以形成下列规范折叠组合中的一种：11-7、13-7A，B，C、14-7Α，Β、12-11、14-11和12-12如Williamsetal·，J.Mol·Biol·264:220-321996中所定义的，以及如http:www.bioc·uzh·chantibodySequencesGermlinesVBase_hVL.html上所示的）。在非限制性实施方案中，Vk结构域中的Ll和L2可以形成下列规范折叠组合中的一种:2-1、3-1、4_1和6-1如在Tomlinsonetal.，EMBOJ·14:4628-381995中所定义的，以及如在http:www.bioc·uzh·chantibodySequencesGermlinesVBase_hVK.html上所不的）。[0118]在一个进一步的实施方案中，具有高度人同源性的抗体的VL结构域中的L1、L2和L3中的全部三个都可以显示出基本上为人的结构。优选的是，具有高度人同源性的抗体的VL结构域显示出与人VL的高度序列同一性序列同源性，而且VL结构域中的高变环显示出与人VL的结构同源性。[0119]在一个实施方案中，具有高度人同源性的抗GPVI抗体的VL结构域可以在框架区FRl、FR2、FR3和FR4上显示出与人VL结构域70%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、97%或更高、或高达99%或甚至100%的序列同一性，此外高变环Ll和高变环L2可以形成与已知在相同人VL结构域中天然存在的规范折叠组合相同的预测的或实际的规范折叠结构的组合。当然，设想与人VH显示出高度序列同一性序列同源性并且与人VH的高变环显示出结构同源性的VH结构域将与显示出与人VL具有高度序列同一性序列同源性并且还与人VL的高变环显示出结构同源性的VL结合域组合，以提供含有具有最大序列的VHVL配对的具有高度人同源性的且与人编码的VHVL配对具有结构同源性的抗体。[0120]“免疫特异性的”、“对......具有特异性的”或以“特异性结合如本文所用，如果抗体以可检测的水平与抗原反应，优选地，亲和常数Ka为大于或等于约ΙΟ%-1、大于或等于约107Μ_1、或大于或等于108Μ_1、或大于或等于1.5108Μ_1、或大于或等于109Μ_1、或大于或等于5IO9IT1,则抗体被说成是“免疫特异性的”、“对抗原具有特异性的”或“特异性结合”抗原。抗体对其同源抗原的亲和力通常也用解离常数Kd表示，并且在某些实施方案中，如果抗体以小于或等于1〇_6Μ、小于或等于1Γ7Μ、小于或者等于1.51Γ8Μ、或小于或等于1Γ8Μ、或小于或者等于5HT9M或小于或等于HT9M的Kd结合抗原，则抗体与抗原特异性结合。抗体的亲和力可使用常规技术容易地确定，例如，ScatchardGetal.Theattractionsofproteinsforsmallmoleculesandions.AnnNYAcadSci1949;51:660-672描述的那些技术。通常可以使用免疫检测方法包括例如ELISA、基于免疫荧光的分析如免疫组织化学（IHC和或荧光激活细胞分选FACS或者通过表面等离子体共振SPR，BIAcore来确定和评估抗体与抗原、细胞或其组织的结合特性。[0121]“分离的核酸如本文所用，“分离的核酸”是与其他基因组DNA序列以及天然伴随天然序列的蛋白质或复合物如核糖体和聚合酶基本上分离的核酸。该术语包括已从其天然存在的环境取出的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。基本上纯的核酸包括分离形式的核酸。当然，这是指最初分离的核酸并且不排除后来通过人工添加到分离的核酸中的基因或序列。[0122]术语“多肽”以其常规含义使用，即为少于100个氨基酸的序列。多肽通常是指单体实体。术语“蛋白质”是指超过100个氨基酸的序列和或多聚体实体。本发明的蛋白质不受限于产品的具体长度。该术语不是指或排除蛋白质的表达后修饰例如糖基化、乙酰化、磷酸化等）以及本领域已知的其他修饰包括天然存在的和非天然存在的）。蛋白质可以是整个蛋白质或其子序列。本发明上下文中的感兴趣的特定蛋白质是包含CDR并能够结合抗原的氨基酸子序列。“分离的蛋白质”是从其天然环境的组分中鉴定和分离和或回收的蛋白质。在优选的实施方案中，分离的蛋白质将被纯化至：（1如通过Lowry法测定的，大于蛋白质的80、85、90、95重量％，并且最优选大于96、97、98或99重量％，（2通过使用旋杯式序列分析仪足以获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或3通过SDS-PAGE在还原性或非还原性条件下使用考马斯蓝或优选银染色显示均质。因为蛋白质天然环境的至少一种组分将不存在，分离的蛋白质包括重组细胞内的原位蛋白质。然而，通常通过至少一个纯化步骤来制备分离的蛋白质。[0123]“同一性”或“相同的如本文所用，术语“同一性”或“相同的”当用于表示两个或更多个氨基酸序列的序列之间的关系时，是指氨基酸序列之间的序列关联性程度，通过具有两个或更多个氨基酸残基的段之间的匹配数量来确定。“同一性”利用通过特定数学模型或计算机程序（即“算法”）解决的间隙比对如果有的话计算的两个或更多个序列中的较小者之间的相同匹配的百分比。相关氨基酸序列的同一性可通过已知方法容易地计算出。这些方法包括但不限于在以下文献中描述的那些方法：ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversityPress,NewYork，1988;Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.ff.,ed.,AcademicPress,NewYork,1993；ComputerAnalysisofSequenceData,PartI,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,HumanaPress,NewJersey，1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje，G·,AcademicPress，1987;SequenceAnalysisPrimer，Gribskov，M·andDevereux，J.，eds.，M.StocktonPress，NewYork，1991;和Carilloetal.，SIAMJ.AppliedMath.48,10731988。用于测定同一"性的优选方法被设计成给出测试序列之间的最大匹配。在公众可用的计算机程序中描述了测定同一性的方法。用于测定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAPDevereuxetal.，Nucl.Acid.Res.\2,3871984；GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison，Wis.、BLASTP、BLASTr^PFASTAAltschuletal，J.Mol.Biol.215,403-4101990JLASTX程序可从国家生物技术信息中心（NCBI和其他来源（BLASTManual，Altschuletal.，NCBNLMNIHBethesda，Md.20894;Altschuletal·，同上）公开获得。众所周知的SmithWaterman算法也可用于测定同一"性。[0124]“修饰的抗体如本文所用，术语“修饰的抗体”包括被改变使得它们不是天然存在的合成形式的抗体，例如包含至少两个重链区但不是两个完整重链的抗体例如结构域缺失的抗体或微型抗体）；被改变以与两个或更多个不同的抗原或单个抗原上的不同表位结合的多特异性形式的抗体例如双特异性、三特异性等）；与scFv分子连接的重链分子等。ScFv分子是本领域中已知的并且描述于例如美国专利5，892，019中。另外，术语“修饰的抗体”包括多价形式的抗体例如与三个或更多个拷贝的相同抗原结合的三价、四价等抗体）。在另一个实施方案中，本发明的修饰的抗体是融合蛋白，其包含至少一个缺少CH2结构域的重链区并包含蛋白质的结合结构域，所述蛋白质包含受体配体对的一个成员的结合区。[0125]“哺乳动物如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括人、家养动物和农场动物以及动物园动物、运动动物或宠物动物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔子等。优选地，哺乳动物是灵长类动物，更优选是人。[0126]“单克隆抗体如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即群体中包含的个体抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同决定簇表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们可以被合成而不被其他抗体污染。修饰词“单克隆”不应被解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，可用于本发明的单克隆抗体可以通过由Kohleretal.，Nature，256:4951975首次描述的杂交瘤方法来制备，或者可以使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备（参见例如美国专利号4,816,567。还可以使用例如在Clacksonetal.，Nature，352:624_6281991和Marksetal·，J.Mol.Biol.,222:581-5971991中描述的技术从噬菌体抗体库分离“单克隆抗体”。[0127]“天然序列如本文所用，术语“天然序列”核苷酸是指与来源于自然界的多核苷酸具有相同核苷酸序列的多核苷酸。因此，“天然序列”蛋白质是与来源于自然界例如来源于任何物种）的蛋白质（例如抗体具有相同的氨基酸序列的蛋白质。这样的天然序列多核苷酸和蛋白质可以从自然界分离或可以通过重组或合成手段产生。如本文使用的术语多核苷酸“变体”是通常与本文具体公开的多核苷酸有一个或多个取代、缺失、添加和或插入的不同的多核苷酸。这样的变体可以是天然存在的或者可以是合成生成的，例如通过修饰本发明的一个或多个多核苷酸序列并评价如本文所述的编码蛋白质的一种或多种生物活性和或使用本领域中众所周知的一些技术中的任何技术。如本文使用的术语蛋白质“变体”是通常本文具体公开的蛋白质有一个或多个取代、缺失、添加和或插入的不同的蛋白质。这样的变体可以是天然存在的，或者可以是合成生成的，例如通过修饰本发明的一个或多个上述蛋白质序列并评价如本文所述的蛋白质的一种或多种生物学活性和或使用本领域众所周知的一些技术中的任何技术。可以在本发明的多核苷酸和蛋白质的结构中进行修饰，并且仍获得编码具有期望特征的变体或衍生蛋白质的功能性分子。当期望改变蛋白质的氨基酸序列以产生本发明蛋白质的等同的或甚至改进的变体或区域时，本领域技术人员通常将改变编码DNA序列的一个或多个密码子。例如，某些氨基酸可以取代蛋白质结构中的其他氨基酸，而不会明显丧失其结合其他蛋白质（例如抗原或细胞的能力。因为是蛋白质的结合能力和性质定义该蛋白质的生物功能活性，可以在蛋白质序列（当然包括其下的DNA编码序列）中进行某些氨基酸序列取代，然而仍获得具有相似性质的蛋白质。因此包括可以在所公开的组合物的氨基酸序列或编码所述蛋白质的相应DNA序列中进行各种改变，而不会明显丧失其生物学效用或活性。在许多情况下，蛋白质变体含有一个或多个保守取代。“保守取代”是其中的氨基酸被具有相似性质的另一种氨基酸取代使得肽化学领域的技术人员将预期蛋白质的二级结构和亲水性基本上不变的取代。如上所述，因此氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑几个前述特征的示例性取代是本领域技术人员众所周知的，并且包括:精氨酸和赖氨酸;谷氨酸和天冬氨酸;丝氨酸和苏氨酸;谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。氨基酸取代可进一步基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和或两亲性质的相似性进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸;带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸;具有相似亲水性值的不带电荷的极性头基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸;天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可代表保守变化的其他氨基酸组包括：（Iala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、th;r;2cys、ser、tyr、thr;3val、ile、leu、met、ala、phe;4lys、arg、his;和（5口116、七5^、1:印、1118〇变体也可以或者可选地含有非保守变化。在一个优选的实施方案中，变体蛋白质通过取代、缺失或添加5个或更少的氨基酸而不同于天然序列。变体还可以（或者可选地通过例如缺失或添加对蛋白质的免疫原性、二级结构和亲水性质具有最小影响的氨基酸来修饰。[0128]“药学上可接受的赋形剂如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。所述赋形剂在施用于动物优选人时不会产生不利的、过敏的或其他不良反应。对于人体施用，制剂应符合监管部门（举例来说如FDA管理局或EM要求的无菌性、热原性和一般安全性和纯度标准。[0129]“特异性如本文所用，术语“特异性”是指与给定靶标例如GPVI特异性结合例如发生免疫反应的能力。蛋白质可以是单特异性的并且含有特异性结合靶标的一个或多个结合位点，或者蛋白质可以是多特异性的并且含有特异性结合相同或不同靶标的两个或更多个结合位点。在一个实施方案中，本发明的抗体对多于一个靶标具有特异性。例如，在一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子与GPVI和第二分子结合。[0130]“单链Fv”又缩写为“sFv”或“scFv”-如本文所用，术语“单链Fv”、“sFv”或“scFv”是包含连接成单个氨基酸链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv氨基酸序列还包含VH和VL结构域之间的肽连接体，其使得sFv能够形成期望的用于抗原结合的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun的ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies，vol·113，RosenburgandMooreeds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-3151994；Borrebaeck1995,同下。[0131]“受试者如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，优选人。在一个实施方案中，受试者可以是等待接收或正在接受医疗护理或者曾经是现在是将是医疗程序的对象，或被监测疾病发展的“患者”，即温血动物，更优选人。[0132]“合成的如本文所用，关于蛋白质的术语“合成的”包括包含不是天然存在的氨基酸序列的蛋白质。例如，非天然存在的蛋白质是天然存在的蛋白质的修饰形式例如，包含诸如添加、取代或缺失的突变或者是包含以线性氨基酸序列连接至第二氨基酸序列其可能是或可能不是天然存在的）的第一氨基酸序列其可能是或可能不是天然存在的）的蛋白质，所述第一氨基酸序列与所述第二氨基酸序列在自然界中不是天然连接的。[0133]“治疗有效量”是指在对靶标不造成显著的负面或不利副作用的情况下旨在实现以下目标的药剂的水平或量：⑴延迟或预防GPVI相关疾病的发作；（2减缓或停止GPVI相关疾病的一种或多种症状的进展、加剧或恶化；⑶使GPVI相关疾病的症状得到缓解；（4降低GPVI相关疾病的严重程度或发生率;或⑶治愈GPVI相关疾病。治疗有效量可以在GPVI相关疾病发作之前施用，起预防或防止作用。可选地或另外地，治疗有效量可以在GPVI相关疾病开始后施用，起治疗作用。[0134]“可变区”或“可变结构域如本文所用，术语“可变区”是指这样的事实，即抗体间可变结构域VH和VL的某些区域的序列广泛不同，并且用于每个特定的抗体对其靶抗原的结合和特异性。然而，变异性不是均匀分布在整个抗体的可变区中。它集中在构成抗原结合位点的一部分的每个VL结构域和VH结构域中称为“高变环”的三段中。νλ轻链结构域的第一、第二和第三高变环在本文中被称为Llλ、L2λ和L3λ，并且可以被定义为包含VL结构域中的残基24-33LIλ，由9、10或11个氨基酸残基组成）、49-53L2λ，由3个残基组成）和90-96L3λ，由6个残基组成）（Moreaetal.,Methods20:267-2792000Jk轻链结构域的第一、第二和第三高变环在本文中被称为LIX、L2κ和L3κ，并且可以被定义为包含¥1结构域中的残基25-33仏11〇，由6、7、8、11、12或13个残基组成）、49-53仏21〇，由3个残基组成）和90-97L3κ，由6个残基组成）（Moreaetal.，Methods20:267-2792000。VH结构域的第一、第二和第三高变环在本文中被称为H1、H2和H3,并且可以被定义为包含VH结构域中的残基25-33〇11，由7、8或9个残基组成）、52-56〇12，由3或4个残基组成和91-105H3,长度是高度可变的）（Moreaetal.,Methods20:267-2792000。除非另有说明，否则术语L1、L2和L3分别是指VL结构域的第一、第二和第三高变环，并且包括从Vk和νλ同种型获得的高变环。术语H1、H2和H3分别是指VH结构域的第一、第二和第三高变环，并且包括从任何已知的重链同种型获得的高变环，包括γ、ε、δ、α或μ。如上文所定义，高变环L1、L2、L3、Hl、H2和H3各自可包含“互补决定区”或“⑶R”的一部分。[0135]“价态如本文所用，术语“价态”是指蛋白质中潜在的靶标结合位点的数量。每个靶标结合位点特异性结合一个靶标分子或靶标分子上的特定位点。当蛋白质包含多于一个靶标结合位点时，每个靶标结合位点可以特异性结合相同或不同的分子例如，可以与不同的配体或不同的抗原或同一抗原上的不同表位结合）。主题结合分子优选具有至少一个对人GPVI分子具有特异性的结合位点。优选地，本文提供的蛋白质是单价的。[0136]“治疗”或“治疗”或“减轻”-如本文所用，术语“治疗”或“减轻”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施;其中目的是预防或减缓减轻靶向的病理状况或病症。需要治疗的患者包括那些已经患有该病症的患者以及那些容易患有该病症的患者或者那些将要预防该病症的患者。如果在接受治疗量的本发明的蛋白质后，患者就以下一项或多项显示可观察的和或可测量的减少或者不存在，则对受试者或哺乳动物成功“治疗”了靶向的病理状况或病症:减少致病细胞的数量;减少致病性细胞的总百分比；和或在一定程度上缓解与特定疾病或病症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率以及改善生活质量问题。用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数可通过医生熟悉的常规程序容易地测量。[0137]本发明涉及与人GPVI结合的分离的人源化蛋白，优选针对抗人GPVI的分离的人源化抗体。在一个实施方案中，本发明的分离的蛋白质是经过纯化的。[0138]在一个实施方案中，本发明的蛋白质与GPVI的胞外结构域结合。[0139]在一个实施方案中，本发明的蛋白质与人GPVI的Ig样C2型结构域2D2结合。[0140]因此，在一个实施方案中，本发明的蛋白质与包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至207的至少一个氨基酸残基的表位结合，或者与包含来自相对于人GPVISEQID勵：13的氨基酸残基114至207具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基的表位结合。[0141]在一个实施方案中，所述表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至187、优选115至187、更优选116至187、更优选117至187、更优选118至186、更优选119至185、更优选120至184、甚至更优选121至183的至少一个氨基酸残基，或者包含来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至187、优选115至187、更优选116至187、更优选117至187、更优选118至186、更优选119至185、更优选120至184、甚至更优选121至183具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。[0142]在一个实施方案中，所述表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至187、优选115至187、更优选116至187、更优选117至187、更优选118至186、更优选119至185、更优选120至184、甚至更优选121至183的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至187、优选115至187、更优选116至187、更优选117至187、更优选118至186、更优选119至185、更优选120至184、甚至更优选121至183具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个氨基酸残基。[0143]在一个实施方案中，所述表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135的至少一个氨基酸残基，或者包含来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。[0144]在一个实施方案中，所述表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个氨基酸残基。[0145]在一个实施方案中，所述表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135的至少一个氨基酸残基，或者包含来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。[0146]在一个实施方案中，所述表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDN0:13的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21个氨基酸残基。[0147]在一个实施方案中，所述表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183的至少一个氨基酸残基，或者包含来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。[0148]在一个实施方案中，所述表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22个氨基酸残基。[0M9]在一个实施方案中，本发明的分离的蛋白质与构象表位结合。[0150]在一个实施方案中，所述构象表位包含人GPVI的至少一个氨基酸残基。[0151]在一个实施方案中，所述构象表位包含人GPVI的Ig样C2型结构域2D2的至少一个氨基酸残基。[0152]在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的114至207的至少一个氨基酸残基。[0153]在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至187、优选115至187、更优选116至187、更优选117至187、更优选118至186、更优选119至185、更优选120至184、甚至更优选121至183的至少一个氨基酸残基，或者包含来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至187、优选115至187、更优选116至187、更优选117至187、更优选118至186、更优选119至185、更优选120至184、甚至更优选121至183具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。[0154]在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至187、优选115至187、更优选116至187、更优选117至187、更优选118至186、更优选119至185、更优选120至184,甚至更优选121至183的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个氨基酸残基，或者来自相对于人6卩¥1SEQIDNO:13的氨基酸残基114至187、优选115至187、更优选116至187、更优选117至187、更优选118至186、更优选119至185、更优选120至184,甚至更优选121至183具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个氨基酸残基。[0155]在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135的至少一个氨基酸残基，或者包含来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的的至少一个氨基酸残基。[0156]在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个氨基酸残基。[0157]在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135的至少一个氨基酸残基，或者包含来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。[0158]在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDN0:13的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21个氨基酸残基。[0159]在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183的至少一个氨基酸残基，或者包含来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。[0160]在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22个氨基酸残基。[0161]在一个实施方案中，所述构象表位包含：[0162]-来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135的至少一个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基;和[0163]-来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183的至少一个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。[0164]在一个实施方案中，所述构象表位包含：[0165]-来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDN0:13的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个氨基酸残基；和[0166]-来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDN0:13的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22个氨基酸残基。[0167]在一个实施方案中，所述构象表位包含：[0168]-来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135的至少一个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基;和[0169]-来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183的至少一个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。[0170]在一个实施方案中，所述构象表位包含：[0171]-来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21个氨基酸残基;和[0172]-来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDN0:13的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22个氨基酸残基。[0173]在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135的至少一个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基;和来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至183的至少一个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至183具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。[0174]因此，在一个实施方案中，本发明的蛋白质与构象表位结合，所述构象表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135的至少一个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDN0:13的氨基酸残基121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基;和来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至183的至少一个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDN0:13的氨基酸残基169至183具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。[0175]在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135的至少一个氨基酸残基或者来自相对于人GPVISEQIDN0:13的氨基酸残基121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基;和来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至180的至少一个氨基酸残基或者来自相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至180具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。[0176]因此，在一个实施方案中，本发明的蛋白质与构象表位结合，所述构象表位包含来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135的至少一个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDN0:13的氨基酸残基121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基;和来自人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至180的至少一个氨基酸残基，或者来自相对于人GPVISEQIDN0:13的氨基酸残基169至180具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。[0177]在一个实施方案中，所述构象表位由以下组成：[0178]-人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135,或者相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列；和[0179]-人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至183,或者相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至183具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列。[0180]因此，在一个实施方案中，本发明的蛋白质与构象表位结合，所述构象表位由以下组成：[0181]-人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135,或者相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列；和[0182]-人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至183,或者相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至183具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列。[0183]在一个实施方案中，所述构象表位由以下组成：[0184]-人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135,或者相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列；和[0185]-人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至180,或者相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至180具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列。[0186]因此，在一个实施方案中，本发明的蛋白质与构象表位结合，所述构象表位由以下组成：[0187]-人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135,或者相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列；和[0188]-人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至180,或者相对于人GPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至180具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列。[0189]本发明的另一目的是与人GPVI结合的分离的蛋白质，其中所述蛋白质与人GPVI优选可溶性人GPVI结合的Kd为小于或等于15nM，优选小于或等于10nM，更优选小于或等于5nM〇[0190]在一个实施方案中，本发明的分离的蛋白质与人GPVI结合的koff为小于或等于约8.lO'ecT1，优选小于或等于约6.lO'ecT1，并且更优选小于或等于约4.lO'ecT1。[0191]在一个实施方案中，本发明的分离的蛋白质与人GPVI结合的1^为至少约5.104IT1SecT1，优选至少约5.5.lOthecT1，更优选至少约5.9.IO4M4seCT1，并且更优选至少约6.104sec_1〇[0192]在一个实施方案中，Kd可以通过表面等离子体共振（SPR，BIAcore使用固定的可溶性GPVI以约700至约1600个共振单位RU相当于约8.5至约11.3fmolmm2、优选约850至约1200RU、更优选约950至约1075RU的剂量和或使用I3BSpH7.4作为运行缓冲液和或使用BIAevaluation3.0版本软件分析数据来测定。在一个实施方案中，可溶性GPVI对应于其C-末端经由连接体举例来说，如经由Gly-Gly-Arg连接体融合至hFc序列的GPVI的胞外结构域。这种可溶性GPVI可以被称为可溶性GPVI-Fc。[0193]下面示出了测定本发明的蛋白质对可溶性GPVI的亲和力的方法：[0194]使用BIAcore2000系统Uppsala，瑞典）用表面等离子体共振来分析本发明的蛋白质与可溶性人GPVI的结合。[0195]使用胺偶联法Wizard程序将可溶性GPVI-Fc以约700至约1600RU相当于约8.5至约11.3fmolmm2、优选约850至约1200RU、更优选约950至约1075RU、并且甚至更优选约960至约1071RU的剂量固定在羧基-甲基葡聚糖CM5传感器芯片上。然后使蛋白质在25°C下以20yLmin的流速在PBSpH7.410mM磷酸盐、138mMNaCl、2.7mMKCl，pH7·42,25·4°C中的固定的GPVI-Fc上通过passover。使用BIAevaluation3.0版本软件通过将数据拟合至结合模型来确定动力学常数kc^krff和亲和力。PBSpH7.4是运行缓冲液。[0196]在一个实施方案中，所述蛋白质是选自由全抗体、人源化抗体、单链抗体、二聚单链抗体、Fv、Fab、Fab’2、去岩藻糖基化抗体、双特异性抗体、diabody、triabody和tetrabody组成的组的抗体分子。[0197]在另一个实施方案中，所述蛋白质是选自由unibody、结构域抗体和纳米抗体组成的组的抗体片段。[0198]在另一个实施方案中，所述蛋白质是选自由亲和体（affibody、affilin、afTitin、adnectin、atrimer、evasin、DARPin、anticalin、avimer、fynomer、versabody和duocalin组成的组的抗体模拟物。[0199]结构域抗体是本领域中众所周知的，并且是指抗体的最小功能结合单位，对应于抗体的重链或轻链的可变区。[0200]纳米抗体是本领域中众所周知的，并且是指含有天然存在的重链抗体的独特结构和功能特性的由抗体衍生的治疗性蛋白质。这些重链抗体可以含有单个可变结构域VHH和两个恒定结构域CH2和CH3。[0201]unibody是本领域中众所周知的，并且是指缺乏IgG4抗体铰链区的抗体片段。铰链区的缺失导致得到大小基本上是传统IgG4抗体的一半并具有单价结合区而不是IgG4抗体的二价结合区的分子。[0202]affibody是本领域中众所周知的，并且是指基于来源于葡萄球菌蛋白A的一个IgG结合结构域的一个58个氨基酸残基的蛋白质结构域的亲和蛋白质。[0203]DARPins设计的锚蛋白重复蛋白质）是本领域中众所周知的，并且是指开发用于利用非抗体蛋白质的结合能力的抗体模拟DRP设计的重复蛋白质技术。[0204]Anticalins是本领域中众所周知的，并且是指另一种抗体模拟技术，其中结合特异性来源于Iipocalins。Anticalins也可以被格式化为双重革巴向蛋白质，称为Duocalins。[0205]Avimers是本领域中众所周知的，并且是指另一种抗体模拟技术。[0206]Versabodies是本领域中众所周知的，并且是指另一种抗体模拟技术。它们是3-5kDa的小蛋白质，具有15%的半胱氨酸，其形成高二硫化物密度支架，替代一般蛋白质所具有的疏水核心。[0207]在一个实施方案中，本发明的蛋白质是单价的，并且优选地选自全单价抗体，人源化单价抗体，单链抗体，Fv，Fab，或者抗体片段，所述抗体片段选自由unibody、结构域抗体和纳米抗体组成的组;或单体抗体模拟物，所述单体抗体模拟物选自由亲和体、affiIin、affitin、adnectin、atrimer、evasin、DARPin、anticalin、avimer、fynomer和versabody组成的组。[0208]在另一个实施方案中，所述蛋白质是包含与治疗剂缀合的抗体或其片段的免疫缀合物。[0209]在另一个实施方案中，所述蛋白质是包含与成像剂缀合的本发明蛋白质的缀合物。所述蛋白质可以用于例如成像应用。[0210]在一个实施方案中，所述蛋白质是单克隆抗体。[0211]在另一个实施方案中，所述蛋白质是多克隆抗体。[0212]本发明的另一个目的是一种抗hGPVI抗体或其抗原结合片段，其中重链的可变区包含以下⑶R中的至少一个：[0213]VH-CDRl:GYTFTSYNMHSEQIDNO:1;[0214]VH-CDR2:GIYPGNGDTSYNQKFQGSEQIDN0:2;和[0215]VH-CDR3:GTWGDWYFDVSEQIDN0:3。[0216]⑶R编号和定义是根据KabatChothia定义。[0217]本发明的另一个目的是抗hGPVI抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区包含以下⑶R中的至少一个：[0218]VL-CDR1:RSSQSLENSNGNTYLNSEQIDN0:4;[0219]VL-CDR2:RVSNRFSSEQIDN0:5;和[0220]VL-CDR3:LQLTHVPWTSEQIDN0:6。[0221]CDR编号和定义是根据KabatChothia定义。[0222]在一个实施方案中，本发明的抗hGPVI抗体或其抗原结合片段包含：[0223]-在重链中，以下CDR中的至少一个：GYTFTSYNMHSEQIDN0:1、GIYPGNGDTSYNQKFQGSEQIDN0:2和GTVVGDWYFDVSEQIDN0:3:和或[0224]-在轻链中，以下CDR中的至少一个：RSSQSLENSNGNTYLNSEQIDN0:4、RVSNRFSSEQIDN0:5和LQLTHVPWTSEQIDN0:6。[0225]在本发明的另一个实施方案中，抗hGPVI抗体或其抗原结合片段在其重链中包含3个CDR:SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3。[0226]在本发明的另一个实施方案中，抗hGPVI抗体或其抗原结合片段在其轻链中包含3个CDR:SEQIDN0:4、SEQIDN0:5和SEQIDN0:6。[0227]在本发明的另一个实施方案中，抗hGPVI抗体或其抗原结合片段包含在其重链中的3个CDR:SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3,以及在其轻链中的3个CDR:SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。[0228]在本发明的另一个实施方案中，抗hGPVI抗体或其抗原结合片段包含在其重链中的3个CDR:SEQIDN0:1、SEQIDN0:2和SEQIDN0:3以及在其轻链中的3个CDR:SEQIDN0:4、SEQIDN0:5和SEQIDN0:6,任选地，其中任何所述序列中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代。[0229]根据本发明，重链和轻链的⑶R1、2和3中的任何一个可以表征为具有与相应SEQIDNO中列出的特定CDR或CDR集合具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。[0230]在本发明的另一个实施方案中，抗hGPVI抗体或其抗原结合片段选自由具有以下氨基酸序列的抗体组成的组：[0231]⑴分别如SEQIDNO:1、2和3所示的重链CDR1、2和3VH-CDR1、VH-CDR2、VH-⑶R3氨基酸序列;和[0232]ii分别如SEQIDN0:4、5和6中所示的轻链CDR1、2和SWL-CDRUVL-CDI^VL-raRS氨基酸序列；[0233]任选地，其中任何所述序列中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代。[0234]在一个实施方案中，本发明的抗GPVI抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区含有序列SEQIDNO:7或由序列SEQIDNO:7组成。[0235]SEQIDN0：7[0236]QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWMGGIYPGNGDTSYNQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGTVVGDWYFDVWGQGTLVTVSS[0237]在一个实施方案中，本发明的抗GPVI抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区含有序列SEQIDN0:8或由序列SEQIDN0:8组成。[0238]SEQIDN0：8[0239]DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLENSNGNTYLNWYQQKPGKAPKLLIYRVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCLQLTHVPffTFGQGTKVEITR[0240]在一个实施方案中，本发明的抗GPVI抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区含有序列SEQIDN0:9或由序列SEQIDN0:9组成。[0241]SEQIDN0：9[0242]DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQSLENSNGNTYLNWYQQKPGKAPKLLIYRVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQLTHVPWTFGQGTKVEIKR[0243]在本发明的另一个实施方案中，抗GPVI抗体ACT017抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有序列SEQIDN0:7或由序列SEQIDN0:7组成，所述轻链可变区含有序列SEQIDN0:8或由序列SEQIDN0:8组成。[0244]在本发明的另一个实施方案中，抗GPVI抗体ACT006抗体或其抗原结合片段包含含有序列SEQIDN0:7或由序列SEQIDN0:7组成的重链可变区和含有序列SEQIDN0:9或由序列SEQIDNO:9组成的轻链可变区。[0245]根据本发明，如上文所述的重链或轻链可变区的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代。[0246]在另一个实施方案中，本发明的抗体包含重链和轻链可变区，所述重链和轻链可变区包含与本文所述的ACT017抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中所述抗体保留了本发明蛋白质的期望的功能特性。[0247]在另一个实施方案中，本发明的抗体包含重链和轻链可变区，所述重链和轻链可变区包含与本文描述的ACT006抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中所述抗体保留了本发明蛋白质的期望的功能特性。[0248]根据本发明，重链可变区包含与SEQIDN0:7具有60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性的序列。[0249]根据本发明，轻链可变区包含与SEQIDN0:8或SEQIDN0:9具有60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性的序列。[0250]在本发明的任何抗体例如ACTO17或ACT006中，指定的可变区和⑶R序列可以包含保守序列修饰。保守序列修饰是指不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可通过本领域已知的标准技术如定点诱变和PCR介导的诱变将修饰引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代通常是其中氨基酸残基被具有相似物理化学性质的侧链的氨基酸残基置换的那些取代。指定的可变区和CDR序列可以包含一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸插入、缺失或取代。在进行取代时，优选的取代是保守修饰。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链例如天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非极性侧链例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、β支链侧链例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和芳族侧链例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。因此，本发明抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基置换，并且可以使用本文所述的测定法对改变的抗体测试保留的功能（即，本文所述的性质）。[0251]在一个实施方案中，本发明还提供结合与ACTO17或ACT006抗体基本上相同的表位的抗体。在本发明中，结合与ACT017或ACT006抗体基本上相同的表位的抗体将分别称为ACTO17样抗体或ACT006样抗体。[0252]在本发明的一些实施方案中，包含VH和VL结构域或其⑶R的抗hGPVI抗体可以包含CHl结构域和或CL结构域，其氨基酸序列是完全的或基本上人的。当本发明的抗原结合蛋白质是旨在用于人类治疗用途的抗体时，通常抗体的整个恒定区或其至少一部分具有完全的或基本上的人氨基酸序列。因此，CHl结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域和CH4结构域，如果存在的话的一个或多个或任何组合就其氨基酸序列而言可以是完全或基本上人的。有利地，CHl结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域和CH4结构域，如果存在的话全都可以具有完全或基本上人的氨基酸序列。在人源化或嵌合抗体或抗体片段的恒定区的情况下，术语“基本上人的”是指与人的恒定区具有至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%、或至少97%、或至少99%的氨基酸序列同一性。这种情况中的术语“人的氨基酸序列”是指由人免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，所述基因包括种系、重排和体细胞突变的基因。本发明还涵盖包含“人”序列的恒定结构域的蛋白质，所述“人”序列的恒定结构域已通过相对于人序列的一个或多个氨基酸添加、缺失或取代而被改变，除了明确要求存在“完全人”铰链区的那些实施方案。本发明的抗hGPVI抗体中“完全人”铰链区的存在对于最小化免疫原性和优化抗体的稳定性都可能是有益的。认为在重链和或轻链的恒定区内、特别是在Fc区内可以进行一个或多个氨基酸取代、插入或缺失。氨基酸取代可以导致用不同的天然存在的氨基酸或用非天然或修饰的氨基酸置换取代的氨基酸。其他结构修饰也是允许的，举例来说，如糖基化模式的变化例如通过添加或缺失N-或0-连接的糖基化位点）。根据抗体的预期用途，可能期望就本发明的抗体与Fc受体的结合特性来修饰本发明的抗体，例如用于调节效应子功能。例如一个或多个半胱氨酸残基可以被引入Fc区中，从而允许在该区域中形成链间二硫键。因此生成的同型二聚体抗体可以具有改善的效应子功能。参见Caronetal·，J.Exp.Med.176:1191-11951992和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-29221992〇[0253]本发明的另一个目的是编码序列SEQIDN0:7的重链可变区的分离的核酸序列。优选地，所述核酸序列是SEQIDNO:10:[0254]SEQIDN0：10[0255]CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCAGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAGACAGGCTCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGAGGTATTTATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCCAGGGCCGAGTTACTATGACTCGGGACACTTCCACCTCTACAGTGTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGCACCGTGGTCGGCGACTGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTGAGCAGT[0256]本发明的另一个目的是编码序列SEQIDN0:8的轻链可变区的分离的核酸序列。优选地，所述核酸序列是SEQIDNO:11:[0257]SEQIDN0：11[0258]GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGTGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAAGTAGTCAGAGCCTTGAGAACAGCAACGGAAACACCTACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGTAAGGCTCCAAAGCTGCTGATCTACAGAGTTTCCAACCGATTCTCTGGTGTGCCAAGCAGATTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCTTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCAGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCTCCAGCTGACTCATGTCCCATGGACCTTCGGTCAGGGCACCAAGGTGGAGATCACCCGG[0259]本发明的另一个目的是编码序列SEQIDN0:9的轻链可变区的分离的核酸序列。优选地，所述核酸序列是SEQIDNO:12:[0260]SEQIDN0：12[0261]GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGTGACAGAGTGACCATCACCTGTAGTGCCAGTCAGAGCCTTGAGAACAGCAACGGAAACACCTACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGTAAGGCTCCAAAGCTGCTGATCTACAGAGTTTCCAACCGATTCTCTGGTGTGCCAAGCAGATTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCCTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTCCAGCTGACTCATGTCCCATGGACCTTCGGTCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGC[0262]本发明的另一个目的是包含编码本发明的抗GPVI抗体的核酸序列的表达载体。在一个实施方案中，本发明的表达载体包含SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12中的至少一个或具有与所述SEQID腸：10-12具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的核苷酸序列的任何序列。[0263]在一个实施方案中，本发明的载体包含序列SEQIDNO:10和编码重链恒定区的序列。编码重链恒定区的序列的非限制性实例是SEQIDNO:14。[0264]SEQIDN0：14[0265]GCCTCCACCAAGGGTCCCTCAGTCTTCCCACTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGTGGCACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCTGCTGTCTTGCAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTCGAGCCTAAGTCATGCGACAAGACTCAC[0266]在一个实施方案中，本发明的载体包含序列SEQIDNO:11或SEQIDNO:12和编码轻链恒定区的序列。编码轻链恒定区的序列的非限制性实例是SEQIDNO:15。[0267]SEQIDN0：15[0268]ACTGTGGCTGCACCAAGTGTGTTCATCTTCCCACCTAGCGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTCGTGTGCCTCCTGAACAACTTCTACCCACGGGAGGCCAAGGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAAGATAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACTCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCCCCTGTCACAAAGAGCTTCAACCGGGGAGAGTGT[0269]在一个实施方案中，本发明的载体包含编码信号肽的序列。信号肽序列的非限制性实例包括但不限于SEQIDNO:16和SEQIDNO:17。[0270]SEQIDN0：16[0271]ATGGATATGCGTGTACCAGCTCAACTACTTGGACTTCTATTGCTTTGGCTTCGTGGTGCTAGATGT[0272]SEQIDNO：17[0273]ATGGACTGGACTTGGAGAATCCTATTCTTGGTTGCTGCAGCTACAGGTGCTCATTCA[0274]在一个实施方案中，本发明的载体包含SEQIDNO:10和编码重链恒定区的序列举例来说，如SEQIDNO:14和信号肽序列。这样的载体的实例是包含SEQIDNO:18的载体。SEQIDNO:18还包含克隆位点。[0275]SEQIDN0：18[0276]GCGGCCGCCACCATGGACTGGACTTGGAGAATCCTATTCTTGGTTGCTGCAGCTACAGGTGCTCATTCACAGGTTCAGCTGGTTCAGTCAGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAGACAGGCTCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGAGGTATTTATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCCAGGGCCGAGTTACTATGACTCGGGACACTTCCACCTCTACAGTGTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGCACCGTGGTCGGCGACTGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTGAGCAGTGCCTCCACCAAGGGTCCCTCAGTCTTCCCACTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGTGGCACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCTGCTGTCTTGCAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTCGAGCCTAAGTCATGCGACAAGACTCACTGATGAGGATCC[0277]在一个实施方案中，本发明的载体包含SEQIDN0:8和编码轻链恒定区的序列举例来说，如SEQIDNO:15和信号肽序列。这样的载体的实例是包含SEQIDNO:19的载体。SEQIDNO:19还包含克隆位点。[0278]SEQIDN0：19[0279]GACGTCACCATGGATATGCGTGTACCAGCTCAACTACTTGGACTTCTATTGCTTTGGCTTCGTGGTGCTAGATGTGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGTGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAAGTAGTCAGAGCCTTGAGAACAGCAACGGAAACACCTACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGTAAGGCTCCAAAGCTGCTGATCTACAGAGTTTCCAACCGATTCTCTGGTGTGCCAAGCAGATTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCTTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCAGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCTCCAGCTGACTCATGTCCCATGGACCTTCGGTCAGGGCACCAAGGTGGAGATCACCCGGACTGTGGCTGCACCAAGTGTGTTCATCTTCCCACCTAGCGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTCGTGTGCCTCCTGAACAACTTCTACCCACGGGAGGCCAAGGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAAGATAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACTCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCCCCTGTCACAAAGAGCTTCAACCGGGGAGAGTGTTGATGATATC[0280]在一个实施方案中，本发明的载体包含SEQIDN0:9和编码轻链恒定区的序列举例来说，如SEQIDNO:15和信号肽序列。这样的载体的实例是包含SEQIDN0:20的载体。SEQIDNO:20还包含克隆位点。[0281]SEQIDN0：20[0282]GACGTCACCATGGATATGCGTGTACCAGCTCAACTACTTGGACTTCTATTGCTTTGGCTTCGTGGTGCTAGATGTGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGTGACAGAGTGACCATCACCTGTAGTGCCAGTCAGAGCCTTGAGAACAGCAACGGAAACACCTACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGTAAGGCTCCAAAGCTGCTGATCTACAGAGTTTCCAACCGATTCTCTGGTGTGCCAAGCAGATTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCCTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTCCAGCTGACTCATGTCCCATGGACCTTCGGTCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCACCAAGTGTGTTCATCTTCCCACCTAGCGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTCGTGTGCCTCCTGAACAACTTCTACCCACGGGAGGCCAAGGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAAGATAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACTCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCCCCTGTCACAAAGAGCTTCAACCGGGGAGAGTGTTGATGATATC[0283]本发明的另一个目的是包含所述载体的分离的宿主细胞。所述宿主细胞可以用于重组生产本发明的抗体。在一个实施方案中，宿主细胞可以是原核生物、酵母或真核生物细胞，优选哺乳动物细胞，举例来说，如:转化有SV40C0S-7，ATCCCRL1651的猴肾CVl系；人胚胎肾系（293细胞或亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞，Grahametal.，J.Gen.Virol.36:591977;幼仓鼠肾细胞BHK，ATCCCCL10;中国仓鼠卵巢细胞-DHFRCH0，Urlaubetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:42161980;小鼠赛尔托利细胞mouseSertolicellsTM4，Mather，Biol.Reprod.23:243-2511980;小鼠骨髓瘤细胞SP20-AG14ATCCCRL1581;ATCCCRL8287或NSOΗΡΑ培养物收集编号：85110503;猴肾细胞（CV1ATCCCCL70;非洲绿猴肾细胞（VER0-76，ATCCCRL-1587;人宫颈癌细胞HELA，ATCCCCL2;犬肾细胞（MDCK，ATCCCCL34;布法罗大鼠肝细胞（buffaloratlivercellsBRL3A，ATCCCRL1442;人肺细胞（W138，ATCCCCL75;人肝细胞（HepG2，HB8065;小鼠乳腺肿瘤（MMT060562，ATCCCCL51;TRI细胞（Matheretal.，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-681982;MRC5细胞;FS4细胞；和人肝癌细胞系OfepG2以及DSM的PERC-6细胞系。适合于这些宿主细胞中的每一种的表达载体也是本领域中众所周知的。应该指出，术语“宿主细胞”通常是指培养的细胞系。“宿主细胞”的定义明确排除了已引入了本发明的编码抗原结合蛋白质的表达载体的整个人类。[0284]本发明的另一个目的是生产抗hGPVI抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在适合于表达抗hGPVI抗体的条件下培养含有编码抗hGPVI抗体的分离的多核苷酸序列的宿主细胞，和回收表达的抗hGPVI抗体。这种重组方法可用于大规模生产本发明的抗hGPVI抗体，包括预期用于体外、离体、体内治疗、诊断用途的单克隆抗体。这些方法是本领域中可用的并且将被本领域技术人员知晓。[0285]在一个实施方案中，本发明的蛋白质可以通过色谱法纯化，优选通过亲和色谱法纯化，更优选通过在蛋白L琼脂糖上的亲和色谱法纯化。[0286]因此，在一个实施方案中，本发明的蛋白质包含结合蛋白LPpL的结构域。在Muzardetal.,AnalyticalBiochemistry388,331_338,2009和Lakhrifetal·，MAbs.2016;82:379-88中描述了将PpL结合活性转移到本发明蛋白质上的方法，这两篇文献通过引用的方式并入本文。[0287]本发明抗体的片段和衍生物其被本申请中使用的术语“抗体”所涵盖，除非另有说明或与上下文明显矛盾），优选ACT017样或ACT006样抗体，可以通过本领域已知的技术进行生产。“片段”包含完整抗体的一部分，通常是抗原结合位点或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、Fab〇2和Fv片段;双抗体;任何抗体片段，其是具有由连续氨基酸残基的一个不间断序列组成的一级结构的蛋白质在本文中称为“单链抗体片段”或“单链蛋白质”），包括但不限于⑴单链Fv分子，（2仅含有一个轻链可变结构域的单链蛋白质，或其含有轻链可变结构域的三个CDR的片段，而不含相关的重链部分和3仅含有一个重链可变区的单链蛋白质或其含有重链可变区的三个CDR的片段，而不含相关的轻链部分;和由抗体片段形成的多特异性抗体。可使用标准方法来获得本发明抗体的片段。例如，根据常规技术，Fab或Fat2片段可以通过蛋白酶消化分离的抗体来生产。应该理解，可使用已知方法来修饰免疫反应性片段，例如用于减缓体内清除并获得更期望的药代动力学特性，所述片段可以用聚乙二醇PEG修饰。PEG偶联和位点特异性缀合至FaM片段的方法在例如Leongetal.,Cytokines163:106-1192001和Delgadoetal.，Br.J.Cancer732:175-1821996中予以描述，这两篇文献的公开内容通过引用的方式并入本文。[0288]可选地，可以修饰编码本发明抗体优选ACT017样或ACT006样抗体的DNA，以编码本发明的片段。然后将修饰的DNA插入到表达载体中并用于转化或转染合适的细胞，其然后表达期望的片段。[0289]本发明的目的是一种组合物，其包含至少一种如上文所述的本发明的蛋白质。[0290]本发明的另一个目的是一种药物组合物，其包含至少一种如上文所述的本发明的蛋白质和至少一种药学上可接受的赋形剂。[0291]可以用在这些组合物中的药学上可接受的赋形剂包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质（例如羧甲基纤维素钠）、聚乙二醇、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。[0292]本发明的另一个目的是一种药物，其包含至少一种如上文所述的本发明的蛋白质。[0293]在一个实施方案中，所述蛋白质是抑制GPVI信号传导和或GPVI的配体信号传导的抗hGPVI抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“抑制”是指蛋白质能够阻断、减少、防止或中和GPVI与其配体的相互作用、GPVI信号传导和或来自GPVI信号传导通路的分子的活化。[0294]GPVI的配体的实例包括但不限于胶原蛋白、纤维蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白和层粘连蛋白。[0295]在一个实施方案中，所述蛋白质是中和性抗hGPVI抗体。[0296]在一个实施方案中，所述蛋白质抑制GPVI与其配体举例来说，如胶原蛋白、纤维蛋白或任何其他能够诱导下游信号传导和血小板活化的GPVI配体的结合。[0297]在一个实施方案中，所述蛋白质抑制和或防止响应于GPVI的配体举例来说，如胶原蛋白）的血小板聚集。在一个实施方案中，所述蛋白质抑制和或防止血小板粘附至GPVI的配体，举例来说，如胶原蛋白。[0298]在一个实施方案中，所述蛋白质抑制和或防止响应于GPVI的配体举例来说，如纤维蛋白）的GPVI依赖性凝血酶产生。在一个实施方案中，所述蛋白质抑制和或防止响应于胶原蛋白和或组织因子的血小板催化的凝血酶产生。[0299]在一个实施方案中，所述蛋白质抑制和或防止GPVI的配体举例来说，如纤维蛋白）经由GPVI引起的血小板募集。[0300]在一个实施方案中，本发明的蛋白质当以约0.1至约10ygmL、优选约0.5至约5ygmL、并且更优选约1至约2ygmL相当于约2至约200nM、优选约10至约ΙΟΟηΜ、并且更优选约20至约40nM的浓度存在时，在全血或富血小板血浆中诱导血小板饱和。[0301]在一个实施方案中，本发明的蛋白质当以至少约15ygmL、优选至少约10ygmL、并且更优选至少约5ygmL的浓度使用时，抑制胶原蛋白诱导的血小板聚集。优选地，当以这样的浓度使用时，本发明的蛋白质完全抑制胶原蛋白诱导的血小板聚集。[0302]在一个实施方案中，本发明的蛋白质用于抑制胶原蛋白诱导的血小板聚集的IC50为约0.5至约IOygmL，优选约1至约6ygmL，更优选约2至约3.2ygmL。[0303]在一个实施方案中，降低50%胶原蛋白诱导的血小板聚集速度的本发明的蛋白质的浓度范围为约〇.5至约5ygmL，优选约1至约3ygmL，更优选约2ygmL。[0304]在一个实施方案中，本发明蛋白质降低胶原蛋白诱导的血小板聚集的强度的浓度范围为约0.5至约10ygmL，优选约1至约6ygmL，更优选约3.2ygmL。[0305]在一个实施方案中，本发明的蛋白质当在体内施用时，举例来说，例如当以0.01至500mg的剂量施用时，不诱导GPVI的耗竭。[0306]在一个实施方案中，本发明的蛋白质当在体内施用时，举例来说，例如当以0.01至500mg的剂量施用时，不引起血小板计数的降低即血小板减少症。[0307]本发明还涉及如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物，用于治疗与GPVI有关的疾病、病症或状况或在其中的用途。[0308]在另一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于调节炎症和或血栓形成中的白细胞-血小板和血小板-内皮的相互作用。因此，根据一个实施方案，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗炎症和或血栓形成。[0309]在另一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于调节优选防止血小板聚集和脱粒。[0310]在另一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗与异常或畸变的巨核细胞和或血小板增殖、分化、形态、迀移、聚集、脱粒和或功能相关的病症。这些病症的实例包括但不限于出血性病症举例来说，如出血倾向和或出血时间延长），如血小板减少症，举例来说，如特发性血小板减少性紫癜（ITP或免疫性血小板减少症。[0311]在另一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗血栓形成病症举例来说，如冠状动脉的血栓性闭塞）、出血性病症、表现出定量或定性的血小板功能障碍的疾病和显示内皮功能障碍的疾病。这些疾病包括但不限于冠状动脉疾病和脑动脉疾病。[0312]在另一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗脑血管疾病，包括中风和缺血、静脉血栓栓塞性疾病举例来说，如涉及腿部肿胀、疼痛和溃疡的疾病、肺栓塞、腹部静脉血栓形成）、血栓性微血管病变、血管性紫癜。[0313]在另一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗与血小板病症和或疾病举例来说，如出血性病症相关的症状。具体地说，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物可用于调节与ITP如紫癜和严重出血问题.）相关的症状。[0314]在另一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗冠状疾病举例来说，如心血管疾病，包括不稳定型心绞痛、心肌梗塞、急性心肌梗塞、冠状动脉疾病、冠状动脉血管重建术、冠状动脉再狭窄、心室血栓栓塞、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病（例如动脉闭塞性病症）、斑块形成、心肌缺血，包括与冠状动脉手术如经皮冠状动脉血管成形术球囊血管成形术手术有关的并发症。关于冠状动脉手术，这种治疗可以经由在该手术之前、期间或之后施用本发明的蛋白质来实现。在一个优选的实施方案中，这种施用可用于预防血管成形术后的急性心肌缺血。[0315]在另一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗由任何可导致血小板聚集的血管损害引起的病症。这样的血管损害包括但不限于血管壁损伤，如导致在其他方面是完整的血管内暴露的高度血栓形成表面的血管损伤，例如导致ADP、凝血酶和或肾上腺素释放的血管壁损伤，在血管狭窄部位发生的流体剪切应力，在动脉粥样硬化斑块部位的破裂和或撕裂以及由气囊血管成形术或粥样硬化切除术引起的损伤。[0316]此外，在某些实施方案中，优选本发明的蛋白质不影响其他血小板属性或功能，如激动剂诱导的血小板形状变化例如，GPIb-vWF介导的血小板活化）、内部血小板颗粒组分的释放、信号转导通路的激活或由不与GPVI相互作用的激动剂引起的血小板活化后钙动员的诱导。[0317]在另一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗与响应于GPVI的配体包括但不限于胶原蛋白、纤维蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白和层粘连蛋白）或响应于其他胞外基质蛋白质的异常信号转导相关的病症。[0318]在另一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗与GPVI在正常表达GPVI的细胞或不表达GPVI的细胞中的异常表达和或活性水平相关的病症。例如，本发明的蛋白质可用于调节与GPVI在通常不表达GPVI的癌（例如肿瘤细胞中的异常表达相关的病症。这样的病症可包括例如与肿瘤细胞迀移和发展成转移相关的病症。[0319]在另一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于调节血小板的免疫调节功能。[0320]在另一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗肝脏、骨髓和外周血的病症。[0321]在另一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗其中血小板通过调节炎症反应而促成的病症，包括但不限于与感染相关的持续或延长的炎症、关节炎、纤维化，或用于治疗其中血小板调节细胞功能的病症，包括但不限于癌细胞增殖和或传播。[0322]与GPVI有关的疾病、病症或状况的其他实例包括但不限于心血管疾病和或心血管事件，举例来说，如动脉血栓形成包括动脉粥样硬化血栓形成、缺血事件、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞（心脏病发作）、急性脑血管缺血（中风）、经皮冠状动脉干预、支架血栓形成、局部缺血性的（ischemic、再狭窄、局部缺血（ischemia急性和慢性）、主动脉及其分支的疾病（如主动脉动脉瘤、血栓形成）、外周动脉疾病、静脉血栓形成、急性静脉炎和肺栓塞、癌症相关血栓形成特鲁索综合征Trousseausyndrome、炎性血栓形成和与感染相关的血栓形成。[0323]在一个实施方案中，本发明的药物组合物或药物用于治疗由于动脉粥样硬化导致的动脉或静脉血栓形成、再狭窄、急性冠状动脉综合征或脑血管意外，优选血栓形成，或在其中的用途。[0324]本发明的另一个目的是治疗与GPVI有关的疾病、病症或状况的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施用本发明的蛋白质、组合物、药物组合物或药物。[0325]优选地，向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的蛋白质。[0326]应该理解，本发明的蛋白质、本发明的组合物、药物组合物或药物的总日用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括正在治疗的疾病和该疾病的严重程度;所用的具体蛋白质的活性;所用的具体组合物;受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食;所用特定蛋白质的施用时间、施用途径和排泄速率;治疗的持续时间；与所用的具体蛋白质联合或同时使用的药物；以及医学领域中众所周知的类似因素。例如，化合物的开始剂量低于达到期望治疗效果所需的剂量的水平，并逐渐增加剂量直至达到期望的效果，这在本领域技术人员的能力范围内。然而，蛋白质的日剂量可以在每个成人每天约〇.01至500mg的宽范围内变化。优选地，组合物含有约1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、150、200、250、300、350、400、450S500mg的活性成分，根据症状调整向待治疗的患者施用的剂量。药物通常含有约〇.Olmg至约IOOOmg的活性成分，优选Img至约500mg的活性成分。[0327]在一个实施方案中，受试者受到与GPVI有关的疾病、病症或状况优选心血管疾病和或事件）的影响，优选被诊断为患有与GPVI有关的疾病、病症或状况优选心血管疾病和或事件）。[0328]在另一个实施方案中，受试者处于发展GPVI有关的疾病、病症或状况优选心血管疾病和或事件的风险中。风险的实例包括但不限于家族史举例来说，如遗传易感性）、种族、年龄、烟草暴露、高血压、高胆固醇、肥胖、缺乏身体活动、糖尿病特别是2型糖尿病）、不健康饮食和有害使用酒精。[0329]为了用于向受试者施用，组合物将被配制成用于施用于受试者。本发明的组合物可以肠胃外、通过吸入喷雾、直肠、鼻部或经由植入的储库进行施用。本文使用的术语施用包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。[0330]适用于注射的形式的实例包括但不限于溶液，举例来说，如无菌水溶液、凝胶剂、分散液、乳剂、混悬液、适合用于在使用之前加入液体后制备溶液或悬浮液的固体形式，举例来说，如粉末、脂质体形式等。[0331]本发明组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。在可接受的载体和溶剂中，可以使用的是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的固定油常规用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备可注射剂，如天然药学上可接受的油如橄榄油或蓖麻油尤其是其聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，如羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型包括乳剂和混悬液的类似分散剂。出于配制的目的，也可以使用通常用于生产药学上可接受的固体、液体或其他剂型的其他常用表面活性剂如TweenS、Spans和其他乳化剂或生物利用度增强剂。[0332]用于施用本发明药物组合物中的蛋白质的时间表和剂量可根据这些产品的已知方法例如使用生产商的说明书来确定。例如，本发明的药物组合物中存在的蛋白质可以以约1至约100mgmL范围内的浓度供应，举例来说，如以lmgmL、5mgmL、10mgmL、50mgmL或10〇11^1]1]^的浓度供应。在一个实施方案中，蛋白质以约1〇11^1]1]^的浓度供应在10〇11^IOmL或500mg50mL的单次使用的小瓶中。在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以包含在pH7.2-7.7的I3BS中的本发明的蛋白质。应该理解，这些时间表是示例性的，考虑到必须在临床试验中确定的药物组合物中特定抗体的亲和力和耐受性，可调整最佳时间表和方案。[0333]在一个实施方案中，本发明的蛋白质可以体外或体内用于鉴定表达GPVI的样品、组织、器官或细胞。[0334]可以在其中使用本发明的蛋白质的测定法的实例包括但不限于ELISA、夹心ELISA、RIA、FACS、组织免疫组织化学、蛋白质印迹和免疫沉淀。[0335]在本发明的一个实施方案中，样品是生物样品。生物样品的实例包括但不限于体液，优选血液，更优选血清、血浆、滑液、支气管肺泡灌洗液、痰液、淋巴液、腹水、尿液、羊水、腹膜液、脑脊髓液、胸膜液、心包液和肺泡巨噬细胞、组织裂解物、活检和由患病组织制备的提取物。[0336]在本发明的一个实施方案中，术语“样品”旨在表示在任何分析之前从个体取得的样品。[0337]在另一个实施方案中，本发明的蛋白质可以被标记用于诊断或检测目的。本文中的标记是指化合物连接有至少一个元素、同位素或化学化合物以能够检测该化合物。标记的实例包括但不限于同位素标记，如放射性同位素或重同位素;磁性、电子或热敏标记以及带色的染料或发光染料。发光染料的实例包括但不限于镧系元素络合物、量子点、荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、苗、萤光黄、级联蓝、德克萨斯红、alexa染料和cy染料。[0338]本发明的另一个目的是一种试剂盒，其包含至少一种本发明的蛋白质。[0339]“试剂盒”意指包含用于特异性检测GPVI表达的至少一种试剂（即例如抗体）的任何制品（例如包装物或容器）。试剂盒可以作为用于实施本发明方法的单元进行推广、分发或销售。此外，任何或全部试剂盒试剂可以提供在保护它们免受外部环境影响的容器内，如密封容器中。试剂盒还可以含有描述试剂盒及其使用方法的包装说明书。[0340]本发明进一步涉及用于抑制GPVI受体功能和下游信号传导从而治疗GPVI相关状况的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的蛋白质。[0341]在一个实施方案中，用于抑制GPVI受体功能和下游信号传导的方法不影响血小板计数、GPVI在血小板表面的表达，也不影响出血时间。[0342]在一个实施方案中，用于抑制GPVI受体功能和下游信号传导的方法是有效且可逆的。[0343]本发明进一步涉及用于抑制GPVI与其配体优选但非排他地为胶原蛋白）结合从而治疗GPVI相关状况的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的蛋白质。[0344]在一个实施方案中，用于抑制GPVI与其配体结合的方法不影响血小板计数、GPVI在血小板表面的表达，也不影响出血时间。[0345]在一个实施方案中，用于抑制GPVI与其配体结合的方法是有效且可逆的。[0346]本发明进一步涉及用于抑制和或预防血小板粘附至胶原蛋白从而治疗GPVI有关状况的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的蛋白质。[0347]本发明进一步涉及用于抑制和或预防胶原蛋白诱导的血小板聚集从而治疗GPVI有关状况的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的蛋白质。[0348]本发明进一步涉及用于抑制和或预防响应于胶原蛋白的血小板活化特别是血小板聚集从而治疗GPVI有关状况的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的蛋白质。[0349]本发明进一步涉及用于抑制和或预防响应于胶原蛋白和或组织因子的凝血酶产生从而治疗GPVI有关状况的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的蛋白质。[0350]本发明进一步涉及用于抑制GPVI与纤维蛋白结合从而治疗GPVI有关状况的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的蛋白质。[0351]本发明进一步涉及用于抑制和或预防GPVI通过纤维蛋白引起的血小板募集从而治疗GPVI有关状况的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的蛋白质。[0352]本发明进一步涉及用于抑制和或预防响应于纤维蛋白的GPVI依赖性凝血酶产生从而治疗GPVI有关状况的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的蛋白质。[0353]在一个实施方案中，向受试者施用本发明的蛋白质不诱导体内GPVI的耗竭。[0354]在一个实施方案中，向受试者施用本发明的蛋白质不诱导血小板计数的降低。因此，在一个实施方案中，向受试者施用本发明的蛋白质不诱导血小板减少症。[0355]在一个实施方案中，向受试者施用本发明的蛋白质不诱导出血时间的增加。[0356]在一个实施方案中，本发明的方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的蛋白质。[0357]附图简要说明[0358]图1是用考马斯蓝染色的凝胶的照片，示出了本发明的蛋白质。MM:分子量标准物，FT:流过流分，PX:纯化的蛋白（从蛋白-L琼脂糖柱洗脱）XM:细胞培养条件培养基。[0359]图2是示出了本发明的两种人源化Fab的等温结合曲线的图。将纯化的GPVI-Fc涂布到微量滴定板上，并以渐增的浓度加入纯化的蛋白质。洗涤后，使用对人Fab片段的碱性磷酸酶偶联特异性抗体显示结合的蛋白质，并在485nm下测量碱性磷酸酶底物的水解。[0360]图3是通过流式细胞术用Alexa488偶联的ACT017获得的曲线。根据生产商的说明书将ACT017偶联到A488。将A488-ACT0017以渐增的浓度加入到来自健康志愿者的人抗凝全血或富血小板血浆。在室温下20分钟后，将样品稀释并立即通过流式细胞术分析。血小板的平均荧光表示为A488偶联的ACTO17浓度的函数。数据来自3次实验中的一个代表性实验。[0361]图4是示出在人富血小板血浆PRP中测量的血小板聚集的曲线。PRP与渐增浓度的纯化的ACT017在37°C、不搅拌的情况下预孵育lOmin，然后通过胶原蛋白（lyg.mL_1触发血小板聚集。在37°C、搅拌下延长孵育，并持续记录透光性的变化。数据来自3次实验中的一个代表性实验。[0362]图5是示出根据响应的速度和强度量化的ACT017抑制胶原蛋白诱导的血小板聚集的能力的曲线图。对每个浓度的ACT017测量血小板聚集的强度和速度。剩余响应按照ACT017存在下的响应与ACT017不存在下的响应的比率XlOO计算，并且使用来自GraphPadPrism5.0软件的非线性回归竞争曲线（log抑制剂vs响应）（三参数绘制作为ACT017浓度的函数的图。曲线来自3次实验中的一个代表性实验。[0363]图6是示出胶原蛋白诱导的血小板聚集的图的组合。报道了通过将胶原蛋白（lygmL加入到已接受载体或渐增剂量的ACT017的小鼠的富血小板血浆PRP触发的血小板聚集的最大程度。[0364]图7是示出GPVI在血小板上的表达的图的组合。将注射前和注射载体或递增剂量的ACT017后30分钟获得的血液与FITC偶联的抗GPVI单克隆抗体3J24—起孵育。左图：用载体ACT17Omgkg或不同剂量的ACTO17治疗的小鼠的血小板的平均荧光。中图和右图：报道用载体或用ACT0174mgkg治疗的个体动物在注射前和注射后30分钟之间的GPVI表达的演变。[0365]图8是示出施用ACT0174mgkg或载体ACT17Omgkg后小鼠血液中血小板数量的图。[0366]图9是示出施用载体Ctrl、ACT0174mgkg或氯吡格雷（血小板上P2Y12ADP受体的一种拮抗剂）（l〇mgkg后30分钟小鼠的出血时间A和失血量⑶的图的组合。[0367]图10是示出在对食蟹猴n=4进行的15分钟输注渐增剂量的ACT017l、2、4、8mgkg结束后30分钟和2小时测量的胶原蛋白诱导的血小板聚集的平均值±SEM强度A和速度⑶。[0368]图11示出在任何治疗前TO或输注载体或渐增剂量（l、2、4、8mgkg的ACT017后24小时测量的食蟹猴的血小板计数。[0369]图12是示出在治疗前（时间=0以及在对食蟹猴输注ACT017l、2、4、8mgkg或载体后30分钟和2小时测量的4个受试者的出血时间的图的组合。[0370]图13是示出在开始对食蟹猴n=8进行两个剂量的ACT0172和8mgkg的一小时输注后的不同时间测量的胶原蛋白诱导的血小板聚集的平均值±SD强度（A和速度velocity，B〇[0371]图14是示出通过流式细胞术在开始进行2mgkg的ACT017的一小时输注后的不同时间测量在食蟹猴血小板n=8上GPVI表达水平的图MFI:平均荧光强度）。实施例[0372]通过以下实施例进一步举例说明本发明。[0373]实施例1:ACT017和ACT006的生产[0374]根据生产商的说明书使用标准条件通过瞬时转染在CHO-S细胞Invitrogen中生产抗体ACT017和ACT006Fab片段）。[0375]简单地说，在即将转染之前，将CHO-S细胞分开并以0.5-1.OXIO6个细胞mL的密度接种于IOmL无血清生长培养基中。然后用包含编码本发明抗体的轻链和重链的序列的载体转染细胞。转染后4至5天，当细胞存活率低于80%时，回收培养上清液。[0376]对于ACT017,使用包含SEQIDNO:19和SEQIDNO:18的载体转染细胞，其中SEQIDNO:19包含编码与信号肽序列融合的ACT017的轻链的恒定区和可变区的序列以及克隆位点，并且其中SEQIDNO:18包含编码与信号肽序列融合的ACT017的重链的恒定区和可变区的序列以及克隆位点。[0377]对于ACT006,使用包含SEQIDNO:20和SEQIDNO:18的载体转染细胞，其中SEQIDN0:20包含编码与信号肽序列融合的ACT006的轻链的恒定区和可变区的序列以及克隆位点，并且其中SEQIDNO:18包含编码与信号肽序列融合的ACT006的重链的恒定区和可变区的序列以及克隆位点。[0378]为了纯化，根据生产商的说明书将用人源化Fab的cDNA瞬时转染的细胞的条件培养基施加到蛋白L琼脂糖柱PIERCE蛋白L琼脂糖目录号20510017上。使用甘氨酸0.IMpH2.5洗脱Fab，并在TrisIMpH11上收集流份以中和pH。在用I3BS透析后，通过测量280nm和320nm下的吸光度进行光散射校正，并使用从该序列测定的0.1%溶液的吸光度值A28OJhl5l5I.5来测定Fab的浓度。通过BCA测定法来证实蛋白质浓度。通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色来评估Fab的纯度。[0379]如图1所示，在非还原条件下，纯化的人源化Fab以42kDa的主带迀移，与其氨基酸序列一致。在二硫键还原后，观察到对应于重链和轻链的23-24kDa的双联体doublet。[0380]实施例2:与GPVI-Fc的结合[0381]如下生产可溶性GPVI-Fc:从第一个甲硫氨酸前的Kozak序列至天冬酰胺269之后紧接预测的跨膜序列PCR-扩增GPVI的预测胞外结构域的开放阅读框。将PCR片段连接到含有人IgGlFc结构域的基因组序列的pCDM8宿主载体中，使得hGPVIcDNA的胞外部分在其C末端经由3个丙氨酸的一个接头融合到hFc序列。将测序的DNA构建体转染到HEK293T细胞中。根据生产商的推荐，通过在蛋白A琼脂糖上进行的亲和色谱法从细胞的条件培养基中纯化GPVI-Fc〇[0382]微量滴定板在4°C下用在PBS中的GPVI-Fc2ygmL，100yL孔包被过夜。非特异性结合位点用IOOyL在I3BS中的1%BSA饱和120min。然后将板与渐增浓度的抗体制剂（IOOyL在含有0.1%BSA和0.1%Tween20的PBS中）一起孵育WOminj轮洗涤后，将板用碱性磷酸酶偶联的抗人Fab的小鼠抗体（100yL，在含有0.1%BSA和0.1%Tween20的I3BS中）孵育120min。最后，向每个孔加入IOOyL底物溶液（对硝基苯基磷酸酯）放置5分钟，用25yL3MNaOH停止比色反应，之后在405nm下读取吸光度。可选地，使用过氧化物酶偶联的蛋白L和邻苯二胺二盐酸盐OPD作为底物检测GPVI结合的抗体，然后在485nm下进行读数。[0383]图2显示了本发明的两种人源化Fab在固定的GPVI-Fc上的等温线结合曲线。分析曲线可计算得出ACT006的半饱和常数为InM和ACT017的半饱和常数为0.5nM。[0384]实施例3:表面等离子体共振BIAcore[0385]使用BIAcore2000系统Uppsala，瑞典）通过表面等离子体共振来分析ACT017、ACT006和Fab9012与可溶性人GPVI的结合。[0386]使用胺偶联法Wizard程序将可溶性GPVI-Fc如实施例2中所述生产的）在醋酸盐缓冲液IOmMPH6中以960至1071RU相当于约6.4至7.15fmolmm2的剂量固定到羧基-甲基葡聚糖CM5传感器芯片上。然后使蛋白质在25°C下以20yLmin的流速在PBSpH7.4IOmM磷酸盐、138mMNaCl、2.7mMKCl，pH7.42,25.4°C中的固定的GPVI-Fc上通过。使用BIAevaluation3.0版本软件通过将数据拟合至结合模型来确定动力学常数KA、KD、kcm、k〇ff和亲和力。PBSpH7.4是运行缓冲液。[0387]结果显示在下面的表1中：[0388][0389]藍[0390]与相同实验条件下研究现有技术中描述的单克隆Fab9012相比，本发明的抗体ACT017和ACT006因此呈现对可溶性GPVI增强的亲和力。[0391]实施例4:生物学数据[0392]材料和方法[0393]人血小板:在3.2%柠檬酸钠上通过静脉穿刺收集来自10天未服药的健康志愿者的血液VacutainerBecktonDickinson，LePont-de-Clais，法国）。所有献血者都是志愿者，他们自由而经通知书面同意这项研究性研究，该研究符合赫尔辛基宣言的伦理标准。[0394]流式细胞术：根据生产商的推荐将人源化FabACT017与Alexa488MolecularProbes偶联。使用抗体缀合物纯化试剂盒MolecularProbes进行分离，并在280和494nm下测定浓度。将不同浓度的A488偶联的人源化Fab与全血或富血小板血浆中的人血小板在室温下暗处孵育20分钟。在I3BS中稀释后，通过荧光激活细胞分选FACSLSRIIBD流式细胞仪分析细胞。[0395]血小板聚集:获得人富血小板血浆PRP后，离心（120xg;15min;20°C，并立即使用。使用APACT®聚集仪来测量血小板聚集，通过向含有各种浓度的人源化Fab的PRP加入Iyg·mL_1的I型胶原蛋白（Hormcollagen，Nycomed，DE开始，并连续记录。测量聚集的速度和强度。[0396]GPVI-人源化小鼠：如以前报道的那样，通过将人gp6基因的序列引入到小鼠gp6基因的ATG处的外显子1中来建立gp6敲入突变小鼠品系（ManginPetal.，AHumanizedGlycoproteinVIGPVIMouseModeltoAssesstheAntithromboticEfficaciesofAnti-GPVIAgents.JPharmacolExpTher.2012；341I：156-63.doi：10.1124jpet.111.189050.Epub2012Jan11。这些小鼠是活的和能生育的，并没有出现任何血液学缺陷。在血小板表面检测到约3700个人GPVI拷贝。[0397]血小板计数：在切断小鼠尾巴后将全血收集到EDTA6mM中。在设置为鼠参数的scilVetabc自动细胞计数器（ScilAnimalCareCompany，Holtzheim，法国）中测定血小板计数。[0398]离体血小板聚集:在注射前和注射渐增剂量的ACT017或等体积的载体后30分钟将血液收集到柠檬酸三钠上，并通过离心获得PRP。血小板计数调整为300109.L'并在四通道CARATTX4聚集仪中连续记录由lyg.mI71I型胶原蛋白触发的血小板聚集。[0399]GPVI表达:在注射前和注射渐增剂量的ACT017或等体积的载体后30分钟将血液样品收集到EDTA上，并与FITC偶联的抗GPVI单克隆抗体3J24IOyg.mL—1—起孵育，该抗体识别人GPVI的表位不同于ACT017的表位，在BeckmanCoulterGallios流式细胞仪上测量荧光。[0400]尾部出血时间和失血量：用解剖刀横向切割麻醉小鼠尾巴的末端3mm，并立即将其浸入37°C下含有13mL0.9%等渗盐水的管中。在30分钟期间内观察和测量出血，并且必要时在10分钟时间点手动停止出血以防止死亡。基于血红蛋白含量测量失血体积。[0401]食蟹猴:在研究中使用以前未经过任何处理的8只食蟹猴。基本根据对于人血小板所述并使用2.5mg.mL_1的胶原蛋白浓度进行血小板聚集测量。在EDTA抗凝血液中测量血小板计数。根据标准临床程序并使用〇.5cmSurgicutt™出血时间装置，在醒着的猴的前臂表面测量出血时间。基本如上所述使用与食蟹猴GPVI交叉反应的市售FITC偶联的抗人GPVI单克隆抗体克隆1G5,Biocytex测量GPVI表达。[0402]结果[0403]ACT017与人血小板的体外结合-通过流式细胞术测定的Alexa488偶联的ACT017与人血小板结合的典型曲线在图3中示出。对于1至2ygmL20至40nM的抗体浓度，在全血和PRP中获得血小板饱和。[0404]体外抑制胶原蛋白诱导的人血小板聚集-与渐增浓度的ACT017—起预孵育人PRP后获得的典型聚集曲线在图4中示出。在这些条件下，当浓度多5ygmL时，ACT017完全抑制胶原蛋白诱导的血小板聚集。[0405]如图5中所示，就响应的速度和强度对ACTO17抑制胶原蛋白诱导的血小板聚集的能力进行定量。在三个不同的供体中，强度和速度的平均IC50分别为3.2±2.5和2±0.7μg.mL-1，而在这两种情况下对于6.7±2.9yg.ml1的浓度均观察到完全抑制，这与结合血小板的结果具有良好的一致性。[0406]这些结果因此证明本发明的蛋白质是胶原蛋白诱导的血小板聚集的有效抑制剂。[0407]希望离体分析ACT017对胶原蛋白诱导的血小板聚集、血小板计数和GPVI表达的作用，GPVI-人源化小鼠接受静脉内注射ACTO171、2或4mgkg或载体。注射后30分钟，收集血液以分析胶原蛋白诱导的血小板聚集、血小板计数和GPVI表达。[0408]如图6所示，当小鼠接受剂量多0.5mgkg的ACT017时，观察到完全抑制胶原蛋白诱导的血小板聚集。[0409]关于GPVI的表达，在治疗前和治疗后回收的样品中以及在来自用载体ACT017Omgkg或不同剂量的ACT017治疗的小鼠的样品之间，血小板的平均荧光没有统计学差异图7,左图）。图7的中图和右图示出了在用载体或ACT0174mgkg治疗的个体动物中在注射前和注射后30分钟之间GPVI表达的演变。[0410]这些结果证明ACT017在体内不诱导GPVI耗竭。[0411]而且，测量了接受载体ACT017Omgkg或ACT0174mgkg的小鼠的血小板计数。如图8所示，证实两组之间没有统计学差异平均值土SD:847.7±110.5Vs842±115.5。[0412]与在对照小鼠（载体注射）中获得的值相比，施用ACT0174mgkg后30min通过横切小鼠尾部测量的出血时间和失血量没有改变（图9。为了比较，氯吡格雷（实验前一天和前两个小时，l〇mgkg治疗的小鼠的出血时间以及失血量显著增加。[0413]该结果证明ACT017在体内不诱导血小板计数的降低，即血小板减少症。[0414]在非人类灵长类中进一步表征ACT017施用的作用。八只食蟹猴参加了该研究。首先，在15分钟内静脉内施用渐增剂量的ACT017l、2、4、8mgkg。在施用后30分钟和2小时时，收集血液。以剂量依赖性方式可逆地抑制血小板聚集图10。剂量从lmgkg增加到2mgkg以及从2mgkg增加到4mgkg使作用增加，而8mgkg与4mgkg相比没有额外的作用。与注射前获得的值相比，注射后24小时测量的血小板计数没有改变（图11。用载体或2、4或SmgkgACT017治疗后观察到出血时间没有显著增加（图12。接下来，在一个洗脱周期后，食蟹猴接受作为1小时灌注施用的ACTO172或8mgkg。在治疗开始后的不同时间（1、1.5、2、4和7小时）测量血小板聚集和GPVI表达（图13和图14。与2mgkg相比，在用8mgkg治疗的食蟹猴中，胶原蛋白诱导的血小板聚集被可逆地抑制，并且作用的持续时间延长（图13。与治疗前的值相比，血小板上的GPVI表达在治疗开始后的不同时间均保持稳定（图14。[0415]总之，这些结果证实在非人灵长类动物中，施用ACT017有效且可逆地抑制GPVI功能而不影响血小板计数、GPVI在血小板表面的表达，也不影响出血时间。[0416]实施例5:表位作图[0417]材料和方法[0418]为了重建靶分子即人GPVI的表位，合成了肽库。通过用专有亲水聚合物制剂接枝，然后使用二环己基碳二亚胺DCC与N-羟基苯并三唑HOBt与叔丁氧基羰基-六亚甲基二胺BocHMDA反应，随后使用三氟乙酸TFA裂解Boc-基团，获得氨基官能化聚丙烯支持体。通过定制改进的JANUS液体处理站PerkinElmer，使用标准Fmoc-肽合成法在氨基官能化固体支持体上合成肽。[0419]使用Pepscan专有的支架上化学连接肽（ChemicallyLinkedPeptidesonScaff〇lds，CLIPS技术来进行结构模拟物的合成。CLIPS技术允许将肽构造成单环、双环、三环、片状折叠、螺旋状折叠及其组合。CLIPS模板与半胱氨酸残基偶联。肽中的多个半胱氨酸的侧链与一个或两个CLIPS模板偶联。例如，将0.5mM的P2CLIPS2，6-双溴甲基吡啶）溶液溶解于碳酸氢铵20mM，pH7.8乙腈1:3vv中。将该溶液加入到肽阵列上。CLIPS模板与肽阵列具有3yL孔的455孔板的固相结合肽中存在的两个半胱氨酸的侧链结合。将肽阵列在该溶液中轻轻摇动30至60分钟，同时被完全覆盖在溶液中。最后，用过量的H2O充分洗涤肽阵列，并在含有1%SDS0.1%β-巯基乙醇的PBSpH7.2溶液的破碎缓冲剂中于70°C超声处理30分钟，然后另外在H2O中超声处理45分钟。除三个半胱氨酸外以类似的方式来制备携带T3CLIPS的肽。[0420]在基于PEPSCAN的ELISA中测试ACT017与每种合成肽的结合。将肽阵列与一级抗体溶液一起孵育4°C过夜）。洗涤后，将肽阵列与适当抗体过氧化物酶缀合物SBA;山羊抗人HRP缀合物，SouthernBiotech，2010-05的11000稀释液在25°C下孵育1小时。洗涤后，加入过氧化物酶底物2,2’-连氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐ABTS和20ylmL的3%H2O2t3I小时后，测量显色。用电荷耦合器件CCD-照相机和图像处理系统对显色进行量化。[0421]从CCD-照相机获得的数值在0到3000mAU的范围内，与标准的96孔板ELISA读数仪相似。对结果进行量化并存储到Peplab数据库中。[0422]为了验证合成肽的质量，平行合成单独的阳性和阴性对照肽组。这些用抗体57.9进行筛选（Posthumusetal.，J.Virology，1990,64:3304-3309〇[0423]分析每组肽线性、螺旋、环状、不连续的强度图，并评价系统性结合。[0424]结果[0425]在几轮条件优化后，表明ACT017系统地识别由肽段GPAVSSGGDVTLQCQ和TVTAAHSGTYRCYSF组成的不连续表位，其中GPAVSSGGDVTLQCQ是识别位点的主要部分，因为含有这一序列的CLIPS约束肽也可以被ACT017结合;然而，与含有这一序列的线性肽没有可检测的结合。[0426]不希望受到任何理论的束缚，假设肽段TVTAAHSGTYRCYSF可能为结合提供了额外的结构环境。[0427]肽段GPAVSSGGDVTLQCQ在小鼠GPVI中被显著修饰，具有几个非同义突变;相反，其在非人灵长类动物中高度保守。不希望受到任何理论的束缚，认为这解释了为什么ACT017与人GPVI和非人灵长类动物GPVI结合但不与鼠GPVI结合。[0428]不希望受到任何理论的束缚，表明ACT17与所鉴定的表位的结合应当损害胶原蛋白与GPVIIg样C2型结构域IDl的结合和或GPVI二聚化以及随后的与胶原蛋白的高亲和性结合。

权利要求：1.一种与人糖蛋白VIhGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中所述蛋白质与构象表位结合，所述构象表位包含：-来自hGPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至142的至少一个氨基酸残基，或来自相对于hGPVISEQIDNO:13的氨基酸残基114至142具有至少60%同一性的序列的至少一个氨基酸残基;和-来自hGPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187的至少一个氨基酸残基，或来自相对于hGPVISEQIDNO:13的氨基酸残基165至187具有至少60%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的与人糖蛋白VIhGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中所述构象表位包含来自hGPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135的至少一个氨基酸残基，或来自相对于hGPVISEQIDNO:13的氨基酸残基121至135具有至少60%同一性的序列的至少一个氨基酸残基;和来自hGPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至183的至少一个氨基酸残基，或来自相对于hGPVISEQIDNO:13的氨基酸残基169至183具有至少60%同一性的序列的至少一个氨基酸残基。3.—种与人糖蛋白VIhGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中所述蛋白质与hGPVI结合的Kd小于15nM，其中所述Kd通过表面等离子体共振法使用960至1071RU的可溶性人GPVI以及使用PBSpH7.4作为运行缓冲液来测量，并且其中所述分离的人源化蛋白质在体内不诱导GPVI耗竭表型。4.根据权利要求1至3中任一项所述的与人糖蛋白VIhGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其是选自由全抗体、人源化抗体、单链抗体、Fv、Fab组成的组的抗体分子;或选自由单抗体、结构域抗体和纳米抗体组成的组的抗体片段；或选自由亲和体、affiIin、affitin、adnectin、atrimer、evasin、DARPin、anticalin、avimer、fynomer^Pversabod}^iij^9^Ji^单体抗体模拟物。5.根据权利要求1至4中任一项所述的与人糖蛋白VIhGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其是单价抗体。6.根据权利要求1至5中任一项所述的与人糖蛋白VIhGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中重链的可变区包含以下⑶R中的至少一个：VH-CDRl:GYTFTSYNMHSEQIDNO:1;VH-CDR2:GRPGNGDTSYNQKFQGSEQIDNO:2;和VH-CDR3:GTWGDWYFDVSEQIDN0:3，或具有与SEQIDNO:1-3具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。7.根据权利要求1至6中任一项所述的与人糖蛋白VIhGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中轻链的可变区包含以下CDR中的至少一个：VL-CDR1:RSSQSLENSNGNTYLNSEQIDN0:4;VL-CDR2:RVSNRFSSEQIDN0:5;和VL-CDR3：LQLTHVPffTSEQIDNO：6,或具有与SEQIDN0:4-6具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。8.根据权利要求1至7中任一项所述的与人糖蛋白VIhGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中重链的可变区包含如权利要求6所限定的CDR中的至少一个，并且轻链的可变区包含如权利要求7所限定的CDR中的至少一个。9.根据权利要求1至8中任一项所述的与人糖蛋白VIhGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中重链的可变区包含以下CDR:GYTFTSYNMHSEQIDN0:1、GIYPGNGDTSYNQKFQGSEQIDN0:2和GTVVGDWYFDVSEQIDN0:3，并且轻链的可变区包含以下CDR:RSSQSLENSNGNTYLNSEQIDN0:4、RVSNRFSSEQIDN0:5和LQLTHVPWTSEQIDN0:6，或者具有与所述SEQIDNO:1-6具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。10.根据权利要求1至9中任一项所述的与人糖蛋白VIhGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中编码重链可变区的氨基酸序列是SEQIDN0:7,编码轻链可变区的氨基酸序列是SEQIDNO:8,或具有与所述SEQIDNO:7或8具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何序列。11.根据权利要求1至9中任一项所述的与人糖蛋白VIhGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中编码重链可变区的氨基酸序列是SEQIDN0:7,编码轻链可变区的氨基酸序列是SEQIDNO:9,或具有与所述SEQIDNO:7或9具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何序列。12.—种组合物，包含根据权利要求1至11中任一项所述的与人糖蛋白VIhGPVI结合的分离的人源化蛋白质。13.—种药物组合物，包含根据权利要求1至11中任一项所述的与人糖蛋白VIhGPVI结合的分离的人源化蛋白质和至少一种药学上可接受的赋形剂。14.根据权利要求13所述的药物组合物，用于治疗GPVI有关状况。15.根据权利要求14所述的用于治疗GPVI有关状况的药物组合物，其中所述GPVI有关状况是选自由于动脉粥样硬化导致的动脉和静脉血栓形成、再狭窄、急性冠状动脉综合征和脑血管意外的心血管疾病。16.—种表达载体，其包含SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12中的至少一个或具有与所述SEQIDNO:10-12具有至少60%同一性的核酸序列的任何序列。

百度查询： 艾科迪科尔生物技术公司 巴黎西岱大学 巴黎第十三大学 国家健康与医学研究院 巴黎-萨克雷大学 抗人GPVI抗体及其用途