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申请/专利权人：上海市东方医院(同济大学附属东方医院)

摘要：本发明提供了核孔蛋白Nup54在制备治疗心肌损伤或者急性心梗的药物中的应用。本发明还提供了一种载体，含有编码核孔蛋白Nup54的基因。还提供了一种重组腺病毒载体，含有编码核孔蛋白Nup54的基因。还提供了一种腺病毒，含有编码核孔蛋白Nup54的基因。还提供了上述载体、重组腺病毒载体、腺病毒在制备治疗心肌损伤或者急性心梗的药物中的应用。通过实验显示，通过核孔蛋白Nup54基因转导，在心梗后，通过调控Serca2a蛋白的核浆转运维持心脏功能，减轻心肌缺血造成的心脏损害，在心梗早期保护心脏功能。

主权项：1.核孔蛋白Nup54在制备治疗急性心梗的药物中的应用，所述的核孔蛋白Nup54的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

全文数据：核孔蛋白Nup54及其载体和重组腺病毒的用途技术领域本发明属于生物技术与医学领域，涉及一种核孔蛋白Nup54，具体来说是核孔蛋白Nup54及其载体和重组腺病毒的用途。背景技术急性心梗myocardialinfarction,MI是严重的心血管疾病类型，是在冠状动脉病变的基础上继发血栓形成，引起冠状动脉供血急剧减少或中断，使相应的心肌严重而持久的缺血所致的部分心肌细胞急性坏死。心梗后心肌收缩力极度减弱，心输出量显著减少，是心梗死亡的常见原因。早期开通梗死相关动脉，维持患者心脏功能是改善患者预后的关键，但是目前急性心梗的治疗存在以下问题：1自发病至首次医疗接触时间过长；2短时间内不具备溶栓条件；3短时间内不具备经皮冠状动脉介入治疗的条件；4具有溶栓或介入治疗的禁忌症。因此，急性心梗后的应急治疗具有紧急和重大的意义。真核细胞的基因表达、细胞生长与分裂都依赖于细胞核与细胞质之间连续的大分子的物质运输与信息交流，这种运输过程通过核孔复合物nuclearporecomplexes，NPCs完成。NPCs大约由30种不同的核孔蛋白nucleoporins，Nups组成，嵌入细胞核被膜形成一个连接核膜内外的通道。核孔复合体的主要功能就是核浆之间的物质转运，还参与或直接调控着诸如转录、复制、DNA损伤及修复、细胞有丝分裂、基因组稳定性、细胞衰老及死亡等各种重要的细胞进程。核孔蛋白Nup54GeneID:53371定位于核孔复合物的中心通道位置，包含FG重复结构域和α-螺旋结构域，对大分子物质的进出有着严格的控制，构成选择性透过屏障，是有效运输mRNA和蛋白质的进出所必需的。通过干预核孔蛋白，调节重要功能基因mRNA的核浆转运，有助于短时间内动员mRNA存量，促进其蛋白翻译，从而发挥心肌保护作用。发明内容针对现有技术中存在的问题，本发明提供了核孔蛋白Nup54及其载体和重组腺病毒的用途，所述的这种核孔蛋白Nup54及其载体和重组腺病毒的用途要解决现有技术中的药物治疗心肌损伤或者急性心梗的效果不佳的技术问题。本发明提供了核孔蛋白Nup54在制备治疗心肌损伤或者急性心梗的药物中的应用，所述的核孔蛋白Nup54的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明还提供了一种载体，其含有编码核孔蛋白Nup54的基因，其碱基序列如SEQIDNO.2所示。本发明还提供了一种重组腺病毒载体，其含有编码核孔蛋白Nup54的基因，其碱基序列如SEQIDNO.2所示。优选的，上述重组腺病毒载体为，将Nup54蛋白编码基因插入pDC316-mCMV-EGFP载体，得到的重组腺病毒载体pDC316-mCMV-Nup54-EGFP。本发明还提供了一种腺病毒，其含有编码核孔蛋白Nup54的基因，其碱基序列如SEQIDNO.2所示。优选的，所述的腺病毒是将Nup54蛋白编码基因插入pDC316-mCMV-EGFP载体，将得到的重组腺病毒载体pDC316-mCMV-Nup54-EGFP转染细胞，得到腺病毒。本发明还提供了上述的载体在制备治疗心肌损伤或者急性心梗的药物中的应用。本发明还提供了上述的重组腺病毒载体在制备治疗心肌损伤或者急性心梗的药物中的应用。本发明还提供了上述的腺病毒在制备治疗心肌损伤或者急性心梗的药物中的应用。本发明筛选了一个核孔蛋白Nup54，提供了含有上述核孔蛋白Nup54基因的腺病毒在急性心梗后，心肌注射改善心功能的方法。本发明发现，提供的Nup54蛋白具有如下1、2或3的功能：1调节心肌细胞中Serca2aSarcoplasmicendoplasmicreticulumcalciumATPase2a的蛋白表达；2调控心肌细胞中mRNA的核浆转运；3改善心梗后心脏功能。本发明的上述调节心肌细胞中Serca2a的蛋白表达均在新生大鼠心室肌细胞neonatalratventriclemyocytes，NRVMs中进行；所述调节心肌细胞中Serca2a的蛋白表达具体通过如下1、2或3来体现：1在NRVMs中干扰和过表达Nup54，Western检测Nup54对Serca2a蛋白的影响：结果显示Nup54能够调控Serca2a蛋白的表达。2在NRVMs中干扰和过表达Nup54，PCR检测Nup54对Serca2a成熟和非成熟mRNA的影响：发现Nup54对Serca2a成熟和非成熟mRNA的表达无显著影响。3在NRVMs中过表达Nup54，荧光素酶实验检测Nup54对Serca2a启动子的影响：结果显示干扰和过表达Nup54均不会对Serca2a启动子活性产生显著的影响。本发明的上述调控心肌细胞中mRNA的核浆转运在NRVMs中进行；所述调控心肌细胞中mRNA的核浆转运具体通过如下1、2或3体现：1在NRVMs中过表达Nup54后分离细胞核浆mRNA，PCR分别检测核浆中Serca2amRNA的含量，发现在心肌细胞中，在Serca2amRNA总量不变的情况下，Nup54以转录后调控的方式，通过影响Serca2amRNA的核浆转运，选择性调节心肌细胞中Serca2a的蛋白表达。2在NRVMs中过表达Nup54，通过RNA结合蛋白免疫沉淀RIP实验研究Serca2amRNA与Nup54蛋白免疫共沉淀的区域；发现Nup54蛋白能够与Serca2amRNA相互作用。3构建Serca2amRNA荧光素酶报告质粒，在HEK293细胞中过表达Nup54，检测Serca2amRNA与Nup54蛋白发生互作的区域，发现Serca2amRNA的3’-untranslatedregionUTR区域与Nup54蛋白相互作用。本发明的上述改善心梗后心脏功能，具体通过如下1和2体现：1在NRVMs中分别干扰和过表达Nup54，检测心肌细胞的钙瞬变，发现Nup54能够通过靶向调节Serca2a的蛋白表达调控心肌细胞的钙瞬变。2建立小鼠急性心梗模型，心脏原位注射Nup54腺病毒，心脏超声检测心功能情况，发现在心梗后心肌注射Nup54腺病毒可以维持和改善心脏功能。上述应用中，所述新生大鼠心肌细胞为离体心脏的心肌细胞。上述应用中，所述调节心肌细胞中Serca2a的蛋白表达通过调控心肌细胞中Serca2amRNA的核浆转运实现。具体的，所述Nup54的心肌保护作用在心肌缺血或者心肌梗死条件下进行实验。本发明发现，所述Nup54的心肌保护作用通过介导Serca2amRNA的核浆转运实现。本发明的实验证明，在NRVMs中过表达Nup54能够增加Serca2a的蛋白表达，而Nup54的干扰减少其蛋白表达。这种心肌细胞中Nup54对Serca2a的特异调节，是通过影响Serca2amRNA核浆运输实现，其过程是通过Serca2amRNA的3’-UTR部分与Nup54蛋白相互作用来完成。NRVMs中Nup54可以通过调节Serca2a的蛋白影响心肌细胞肌浆网的Ca2+回收能力。小鼠急性心梗后心脏原位注射Nup54腺病毒，可以部分抵抗心功能的恶化，表明Nup54是一种新的具有心肌保护作用的蛋白质，为临床方面提供一种新的治疗策略。本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明提供了一种核孔蛋白Nup54腺病毒在治疗哺乳动物心肌梗死中的应用。实验研究结果显示，通过核孔蛋白Nup54基因转导可以在哺乳动物心梗后，通过调控Serca2amRNA的核浆转运维持心脏功能，减轻心肌缺血造成的心脏损害，在心梗早期保护哺乳动物心脏功能。核孔蛋白Nup54可以作为心肌损伤进行干预的靶点。附图说明图1显示了NRVMs中腺病毒介导的Nup54过表达。其中，图A，Nup54腺病毒载体构建的模式图；图B，Nup54腺病毒过表达后的Nup54的蛋白检测；图C，荧光显微镜检测Nup54腺病毒过表达的结果。过表达的Nup54在核孔定位，比例尺为100um。图2显示了NRVMs中干扰Nup54对Serca2a蛋白的影响。其中，图A为Nup54干扰效率测定mRNA水平；图B为Nup54干扰效率测定蛋白水平；图C为三次干扰实验的Nup54蛋白定量分析结果统计；图D为Nup54干扰后心肌细胞中主要蛋白的检测结果；图E为三次干扰实验的蛋白定量分析结果统计；*表示P上海市东方医院（同济大学附属东方医院）核孔蛋白Nup54及其载体和重组腺病毒的用途4SIPOSequenceListing1.01507PRT智人Homosapiens1MetAlaPheAsnPheGlyAlaProSerGlyThrSerGlyThrAlaAla151015AlaThrAlaAlaProAlaGlyGlyPheGlyGlyPheGlyThrThrSer202530ThrThrAlaGlySerAlaPheSerPheSerAlaProThrAsnThrGly354045ThrThrGlyLeuPheGlyGlyThrGlnAsnLysGlyPheGlyPheGly505560ThrGlyPheGlyThrThrThrGlyThrSerThrGlyLeuGlyThrGly65707580LeuGlyThrGlyLeuGlyPheGlyGlyPheAsnThrGlnGlnGlnGln859095GlnThrThrLeuGlyGlyLeuPheSerGlnProThrGlnAlaProThr100105110GlnSerAsnGlnLeuIleAsnThrAlaSerAlaLeuSerAlaProThr115120125LeuLeuGlyAspGluArgAspAlaIleLeuAlaLysTrpAsnGlnLeu130135140GlnAlaPheTrpGlyThrGlyLysGlyTyrPheAsnAsnAsnIlePro145150155160ProValGluPheThrGlnGluAsnProPheCysArgPheLysAlaVal165170175GlyTyrSerCysMetProSerAsnLysAspGluAspGlyLeuValVal180185190LeuValPheAsnLysLysGluThrGluIleArgSerGlnGlnGlnGln195200205LeuValGluSerLeuHisLysValLeuGlyGlyAsnGlnThrLeuThr210215220ValAsnValGluGlyThrLysThrLeuProAspAspGlnThrGluVal225230235240ValIleTyrValValGluArgSerProAsnGlyThrSerArgArgVal245250255ProAlaThrThrLeuTyrAlaHisPheGluGlnAlaAsnIleLysThr260265270GlnLeuGlnGlnLeuGlyValThrLeuSerMetThrArgThrGluLeu275280285SerProAlaGlnIleLysGlnLeuLeuGlnAsnProProAlaGlyVal290295300AspProIleIleTrpGluGlnAlaLysValAspAsnProAspSerGlu305310315320LysLeuIleProValProMetValGlyPheLysGluLeuLeuArgArg325330335LeuLysValGlnAspGlnMetThrLysGlnHisGlnThrArgLeuAsp340345350IleIleSerGluAspIleSerGluLeuGlnLysAsnGlnThrThrSer355360365ValAlaLysIleAlaGlnTyrLysArgLysLeuMetAspLeuSerHis370375380ArgThrLeuGlnValLeuIleLysGlnGluIleGlnArgLysSerGly385390395400TyrAlaIleGlnAlaAspGluGluGlnLeuArgValGlnLeuAspThr405410415IleGlnGlyGluLeuAsnAlaProThrGlnPheLysGlyArgLeuAsn420425430GluLeuMetSerGlnIleArgMetGlnAsnHisPheGlyAlaValArg435440445SerGluGluArgTyrTyrIleAspAlaAspLeuLeuArgGluIleLys450455460GlnHisLeuLysGlnGlnGlnGluGlyLeuSerHisLeuIleSerIle465470475480IleLysAspAspLeuGluAspIleLysLeuValGluHisGlyLeuAsn485490495GluThrIleHisIleArgGlyGlyValPheSer50050521524DNA智人Homosapiens2atggccttcaattttggggctccctcgggcacctccggtaccgctgcagccaccgcggcc60cccgcgggtgggtttggaggatttgggacaacatctacaactgcaggttctgcattcagc120ttttctgccccaactaacacaggcactactggactctttggtggtactcagaacaaaggt180tttggatttggtactggttttggcacaacaacgggaactagtactggtttaggtactggt240ttgggaactggactgggatttggaggatttaatacacagcagcagcagcaaactacatta300ggtggtctcttcagtcagcctacacaagctcctacccagtccaaccagctgataaatact360gcgagtgctctttctgctccaacgctgttgggagatgagagagatgctattttggcaaaa420tggaatcaactgcaggccttttggggaacaggaaaagggtatttcaacaataatattccg480ccagtggaattcacacaagaaaatcccttttgccgatttaaggcagtaggttatagttgc540atgcccagtaataaagatgaagatgggctagtggttttagttttcaacaaaaaagaaaca600gagattcgaagccaacaacaacagttggtagaatcattgcataaagttttgggaggaaac660cagacccttactgtaaatgtagagggcactaaaacattgccagatgatcagacagaagtt720gttatttatgttgttgagcgttcgccaaatggtacttcaagaagagttccagctacaacg780ctatatgcccattttgaacaagccaatataaaaacacaattgcagcaacttggtgtaacc840ctttctatgactagaacagaactttctcctgcacagatcaaacagcttttacagaatcct900cctgctggtgttgatcctattatctgggaacaggccaaggtagataaccctgattctgaa960aagttaattcctgtaccaatggtgggttttaaggaacttctccgaagactgaaggttcaa1020gatcagatgactaagcagcatcaaaccagattagatatcatatctgaagatattagtgag1080ctacaaaagaatcaaactacatctgtagccaaaattgcacaatacaagaggaaactcatg1140gatctttcccatagaactttacaggtcctaatcaaacaggaaattcaaaggaagagtggt1200tatgccattcaggctgatgaagagcagttgcgagttcagctggatacgattcagggtgaa1260ctaaatgcacctactcagttcaagggccgactaaatgaattgatgtctcaaatcaggatg1320cagaatcattttggagcagtcagatctgaagaaaggtattacatagatgcagatctgtta1380cgagaaatcaagcagcatttgaaacaacaacaggaaggccttagccatttgattagcatc1440attaaagacgatctagaagatataaagctggtcgaacatggattgaatgaaaccatccac1500atcagaggtggtgtctttagttga1524341DNA人工序列ArtificialSequence3cgtagaacgcagatcgaattcatggccttcaattttggggc41446DNA人工序列ArtificialSequence4gcccttgctcaccatgaattcactaaagacaccacctctgatgtgg46

权利要求：1.核孔蛋白Nup54在制备治疗心肌损伤或者急性心梗的药物中的应用。2.一种载体，其特征在于：含有编码核孔蛋白Nup54的基因。3.一种重组腺病毒载体，其特征在于：含有编码核孔蛋白Nup54的基因。4.根据权利要求3所述的一种重组腺病毒载体，其特征在于：所述的重组腺病毒载体是将Nup54蛋白编码基因插入pDC316-mCMV-EGFP载体，得到重组腺病毒载体pDC316-mCMV-Nup54-EGFP。5.一种腺病毒，其特征在于：含有编码核孔蛋白Nup54的基因。6.根据权利要求5所述的一种腺病毒，其特征在于：所述的腺病毒是将Nup54蛋白编码基因插入pDC316-mCMV-EGFP载体，将得到的重组腺病毒载体pDC316-mCMV-Nup54-EGFP转染细胞，得到腺病毒。7.权利要求2所述的载体在制备治疗心肌损伤或者急性心梗的药物中的应用。8.权利要求3所述的重组腺病毒载体在制备治疗心肌损伤或者急性心梗的药物中的应用。9.权利要求5所述的腺病毒在制备治疗心肌损伤或者急性心梗的药物中的应用。

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