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申请/专利权人：重庆医科大学

摘要：本发明公开了一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统及其构建与应用，所述荧光生物传感系统包括哑铃型DNA探针DSP、CRISPRCas12a蛋白、crRNA与荧光报告探针；所述哑铃DNA探针内含四个Dam甲基转移酶识别位点，在Dam酶存在时被甲基化并切割形成含3’端羟基的DNA链，3’端羟基被TdT末端转移酶识别并经无模板扩增反应延伸出富含T碱基的DNA长单链；CRISPRCas12a蛋白与富含A碱基的crRNA特异性识别DNA长单链并与其互补，引发Cas12a顺式切割活性并激发反式切割活性，剪切荧光报告探针从而产生荧光信号。本发明能实现Dam甲基转移酶的超灵敏、高特异性检测，且检测限低、检测速度快，能在3h内完成检测。

主权项：1.一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统，其特征在于，包括哑铃型DNA探针、CRISPRCas12a蛋白、crRNA与荧光报告探针；所述哑铃型DNA探针的制备方法为：采用如SEQIDNO.1所示序列的哑铃单链，所述哑铃单链5’端修饰有磷酸基团P、3’端连接有OH，在DNA连接酶的作用下，5’端磷酸基团P与3’端OH连接形成封闭的哑铃环，连接端口处为5’-GAAG-3’，得到哑铃型DNA探针；所述哑铃型DNA探针内含四个Dam甲基转移酶识别位点，所述Dam甲基转移酶识别位点的序列为5’-GATC-3’，两两形成回文序列；存在Dam甲基转移酶时，所述哑铃型DNA探针被甲基化并切割形成两条发夹结构和一条DNA双链，即四条含3’端羟基的DNA链，所述DNA链的3’端羟基被TdT末端转移酶识别并经无模板扩增反应延伸出富含T碱基的DNA长单链；所述CRISPRCas12a蛋白与富含A碱基的crRNA特异性识别所述DNA长单链并与其互补，引发Cas12a顺式切割活性并激发反式切割活性，将两端分别标记有荧光基团与荧光淬灭基团的荧光报告探针剪切从而产生荧光信号；不同浓度的Dam甲基转移酶催化反应可产生不同强度的荧光信号；所述crRNA的序列如SEQIDNO.2所示，所述荧光报告探针的序列如SEQIDNO.3所示；所述荧光基团选自HEX、FAM、Cy3、Cy5中的至少一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3中的至少一种；切割哑铃型DNA探针使用的剪切酶为DpnI甲基化限制性内切酶；切割哑铃型DNA探针时还需要加入S腺苷甲硫氨酸；所述无模板延伸反应需加入原料脱氧胸腺嘧啶核苷酸和TdT末端转移酶的激活剂，所述激活剂为钴离子。

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