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申请/专利权人：湖南农业大学
摘要：本发明公开了一种赤眼鳟肾脏细胞系的构建方法及应用，由赤眼鳟肾脏经原代培养、传代培养所得。上述赤眼鳟肾脏细胞系的构建方法为：赤眼鳟消毒后取肾脏组织，漂洗剪碎后，0.25％胰蛋白酶‑EDTA室温消化20min，采用100目灭菌滤网过滤收集细胞，完全培养基重悬混匀，得到重悬混匀液于细胞培养瓶中恒温培养至细胞铺满瓶，用0.25％胰蛋白酶‑EDTA消化液消化后，加入完全培养基继续培养，传代15次后，冻存即获得赤眼鳟肾脏细胞系。本发明所构建的肾脏细胞系对草鱼呼肠孤病毒敏感，且外源基因可在该细胞系中表达，可直接应用于病原特性研究及外源基因功能研究等。该构建方法适用于其他鱼类肾脏细胞系的构建。
主权项：1.一种赤眼鳟肾脏细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：赤眼鳟肾脏获取：取健康赤眼鳟，于浓度为0.1％高锰酸钾溶液浸泡消毒30min，使用75％酒精擦拭鱼体表面，无菌手术取出肾脏组织，置于浓度为70％酒精中浸泡1min；步骤2：原代培养：将通过步骤1获取的肾脏组织使用PBS消毒洗液冲洗3-4次，漂洗培养基冲洗2次，将肾脏组织剪成大约1mm3的小块，加入约10倍组织块体积的0.25％胰蛋白酶-EDTA，28℃消化20min，加入2mL基础培养基终止消化，使用100目灭菌滤网过滤至50mL离心管中，再用2-3mL基础培养基冲洗滤网，800rpm离心10min，弃上清，加入2mL基础培养基重悬沉淀，再次过滤至50mL离心管中，用2-3mL基础培养基冲洗滤网，800rpm再次离心10min，弃上清。加入5mL增殖培养基重悬沉淀，分装至25cm2的培养瓶中，正置于28℃细胞培养箱中培养，每天观察细胞生长情况，根据需要更换细胞增殖培养基；步骤3：传代培养：待原代细胞数目增多，细胞生长成单层铺满细胞培养瓶后，使用PBS缓冲液清洗2次，以0.25％胰蛋白酶-EDTA消化法传代悬起细胞，首次按1:1进行传代，此后按1:2进行传代，于28℃细胞培养箱中继续培养；每8-12天传代一次；15代以后所用传代培养基为含8％-10％胎牛血清的M199培养基；至此，所述赤眼鳟肾脏细胞系建立成功。
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百度查询： 湖南农业大学 一种赤眼鳟肾脏细胞系的构建方法及应用
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