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申请/专利权人：新加坡科技研究局

摘要：本发明涉及一种从多于一种类型的核酸的样品中制备双链DNA文库的无偏且同时扩增的方法。该方法包括提供单链和或双链DNA和或RNA作为模板；通过将第一DNA链生成引物与模板粘合来制备第一DNA链，所述第一DNA链生成引物包括i第一衔接子序列，随后是多聚胸苷序列、随机核苷酸V和随机核苷酸N，和ii第一衔接子序列，其后是联合或独立选自B、D、H或V的六个随机核苷酸；通过将第二DNA链生成引物与第一DNA链粘合来制备第二DNA链，所述第二DNA链生成引物包含第二衔接子序列，随后是联合或独立选自B、D、H或V并从其延伸的八个重复随机核苷酸；通过聚合酶链式反应扩增第二条DNA链。

主权项：1.一种无偏且同时扩增的方法，用于从与非核酸分子相比含量显着较低的多于一种类型的核酸的样品中制备文库，其中该方法包括：提供多于一种类型的核酸样品，包括单链和或双链DNA和或RNA，作为后续延伸和扩增的模板；从所述样品制备第一DNA链，包括将第一DNA链生成引物与任何DNA和或RNA模板粘合，以及从粘合的第一DNA链生成引物延伸，包括使用能够从DNA和或RNA模板中的任一个或两者一锅合成第一DNA链以获得第一DNA链的DNA聚合酶，其中第一DNA链生成引物包括：第一核苷酸序列，其在5'端包括第一衔接子序列，其后是多聚胸苷序列和两个随机核苷酸，所述多胸苷序列包括至少十个胸苷碱基，其后是随机核苷酸V，并进一步随后是随机核苷酸N，其中V和N是根据IUPAC核苷酸密码，以及第二核苷酸序列，其在5'末端包括第一衔接子序列，随后是六个重复随机核苷酸，所述六个重复随机核苷酸中的每一个根据IUPAC核苷酸密码联合或独立地选自B、D、H或V，制备第二链DNA或DNA片段，包括在从DNA和或RNA模板解离并使其变性后将第二DNA链生成引物粘合至第一DNA链，并从粘合的第二DNA链生成引物延伸，包括使用具有链置换活性的DNA聚合酶，其中所述第二DNA链生成引物包括：一随机核苷酸序列，其在3'-末端包括多个随机核苷酸，以及于其5'端的第二衔接子序列，其物理连接至随机核苷酸序列，其中所述多个随机核苷酸包括八个重复随机核苷酸，其中所述八个重复随机核苷酸中的每一个根据IUPAC核苷酸密码联合或独立地选自B、V、D、H或V；通过聚合酶链式反应扩增DNA或DNA片段的第二链，包括使一对扩增引物粘合，所述扩增引物包括一个扩增引物中5'-末端的第一衔接子序列和另一个扩增引物中5'-末端的第二衔接子序列将扩增引物连接至第二条DNA链或DNA片段以获得多个扩增子，使得每个扩增子至少包含第一和第二衔接子序列，其中第一和第二衔接子序列各自具有至少一个通过甲基化修饰的核苷酸；和将扩增子片段化成多个双链DNA片段，包括使扩增子与甲基化特异性限制酶反应以获得不存在第一和第二衔接子序列的双链DNA片段。

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