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申请/专利权人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)

摘要：本发明涉及一种高效拯救禽冠状病毒的方法及其应用，属于冠状病毒反向遗传技术领域。为了建立一种能够快速、高效拯救禽冠状病毒的反向遗传学技术方法，本发明通过优化和构建嵌合转录元件组，采用CPER技术将嵌合转录元件组序列和禽冠状病毒基因组序列按5’到3’方向首尾连接，快速构建包含嵌合转录元件组和禽冠状病毒基因组全长cDNA的环状克隆，通过与禽冠状病毒核蛋白真核表达载体共转染细胞，在胞内实现病毒基因组的转录并完成病毒包装，从而快速拯救获得禽冠状病毒。该方法操作简单、高效，可构建以禽冠状病毒为载体嵌合表达外源基因的反向遗传重组病毒，为研究病毒的致病和免疫机理、开发新型嵌合疫苗等提供了高效的技术工具。

主权项：1.一种拯救禽冠状病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将核苷酸序列如SEQIDNO.1~SEQIDNO.9任意一项所示的嵌合转录调控序列TRS克隆至pUC57载体中进行测序鉴定，获得质粒pUC-TRS；S2、以S1中所述TRS序列为模板，在TRS序列两端分别设计引物；S3、将禽冠状病毒基因组序列随机分为大小近似的N个片段，分别在各个片段两端设计引物，其中片段1的5’端引物包含与S1中TRS序列3’端同源的50~60nt，片段N的3’端引物包含与S1中TRS序列5’端同源的50~60nt，另外每个片段的首尾部分序列与相邻片段重复40~60nt，且各片段之间引物对的退火温度相近；S4、以S1中质粒pUC-TRS为模板，利用S2中设计合成的TRS序列上下游引物，用高保真DNA聚合酶扩增获得TRS片段；S5、提取禽冠状病毒RNA，将RNA转录为cDNA，用高保真DNA聚合酶采用S3所设计的引物对分别扩增得到N个基因组片段；S6、根据禽冠状病毒核蛋白基因序列设计引物，以S5所述cDNA为模板，扩增核蛋白基因的编码序列并克隆至真核表达载体中，构建获得禽冠状病毒核蛋白真核表达载体pCAGGS-N；S7、以S4中获得的TRS片段和S5中获得的N个基因组片段为模板，用高保真DNA聚合酶进行环形聚合酶延伸反应，获得含有转录调控序列和禽冠状病毒基因组序列的环形产物；S8、将S7中获得的环形产物和S6中获得的禽冠状病毒核蛋白真核表达载体共转染细胞系，转染后培养4天收集细胞及上清；S9、将S8中的细胞及上清反复冻融3次，接种8~9日龄SPF鸡胚尿囊腔，继续培养96~120h后收集鸡胚尿囊液，获得禽冠状病毒反向遗传拯救毒株。

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