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申请/专利权人：上海欧易生物医学科技有限公司

摘要：本发明首次创新公开了一种在同一肺脏样本中同时进行单细胞悬液和单细胞核悬液制备、同时进行单细胞测序和单细胞核测序的方法。本发明还公开用于前述方法中的试剂盒。本发明所述技术方案提高了样本的使用效率，同时又能够挖掘更全面的生物学信息，解答更深层次的生物学问题，具有广泛应用前景。

主权项：1.在同一肺脏组织中同时进行细胞、细胞核悬液的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：（一）样本准备：取小鼠肺脏组织，清洗，剪碎，将剪碎的组织块转移至离心管中；所述的小鼠肺脏组织大小为150~200mg；使用预冷的含1%BSA的HBSS进行清洗，其中，所述清洗的次数为1-3次；所述离心管是指15mL的离心管；（二）酶解：加入酶解液置于恒温摇床；所述酶解液成分及终浓度为:0.2%~0.3%胰蛋白酶、30~40UmL胶原酶Ⅳ、0.05%~0.2%DNaseⅠ、HBSS；所述酶解液的体积为4~6mL；所述摇床的条件为：37℃恒温摇床10~15min；（三）分离：分离得到上清、沉降的组织沉淀；所述分离的具体步骤为：加入预冷的含1%BSA的HBSS吹打组织，静置待组织块完全沉降，上清用于单细胞悬液的制备，底部组织沉淀用于单细胞核悬液的制备；所述的加入预冷的含1%BSA的HBSS的体积为3~7mL；（四）悬液制备：单细胞悬液的制备：取前述上清进行过筛和离心、加入红细胞裂解液混匀后静置，离心，加入预冷的含1%BSA的HBSS重悬洗涤，得到单细胞悬液；所述单细胞悬液的制备中，用移液器吸取上清经40μm的筛网过滤至新的15mL离心管中，离心条件为500-800×g、4~6℃、离心7~10min，弃上清；所述加入的红细胞裂解液体积为5~10mL；所述的静置的时间为3~7min；所述离心条件为500-800×g、4~6℃、离心7~10min；所述的加入预冷的含1%BSA的HBSS的体积为5~10mL；所述洗涤条件为100~300×g、4~6℃、5~10min；单细胞核悬液的制备：向前述沉降的组织沉淀中加入细胞核洗涤缓冲液，洗涤、第一次离心后弃上清；然后使用预冷固定液重悬细胞核沉淀，冰上固定孵育，第二次离心后弃上清；接着加入细胞裂解缓冲液，冰上孵育；随后加入细胞核洗涤缓冲液，第三次离心弃上清；最后用含有0.4UμLSUPERaseRNaseInhibitor、1%BSA的PBS重悬以得到最终的细胞核悬液；所述单细胞核悬液的制备中，所述细胞核洗涤缓冲液的成分及终浓度为：10mMTris-HClpH=7.4、0.1mMEDTA、10mMNaCl、0.4UμLSUPERaseRNaseInhibitor、1mMDTT、1%BSA、1%ProteaseInhibitorCocktail；所述细胞核洗涤缓冲液的体积为5~10mL；所述第一次离心条件为500~1000×g、4~6℃、5~10min；所述的固定液成分及终浓度为：0.1%~0.3%甲醛、0.05%~0.1%乙醇、0.4UμLSUPERaseRNaseInhibitor、PBS；所述加入固定液的体积为2~4mL；所述冰上固定孵育条件为0~4℃、孵育5~10min；所述第二次离心的条件为：800~1000×g、4~6℃、5~10min；所述细胞裂解缓冲液的成分及终浓度为：10mMTris-HClpH=7.4、0.1mMEDTA、10mMNaCl、0.3%~0.5%NP40、0.3%~0.5%vvTritonx-100、0.4UμLSUPERaseRNaseInhibitor、1mMDTT、1%ProteaseInhibitorCocktail；所述冰上孵育是指0~4℃、孵育5~7min；所述第三次离心条件为300~500×g、4~6℃、5~10min。

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