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申请/专利权人：上海市东方医院(同济大学附属东方医院)

摘要：本发明公开了一种由改进的piggyBac转座子介导的基因整合方法及其应用，涉及基因工程技术领域，其技术要点为：所述方法包括以下步骤：S1、高效piggyBac转座系统的构建，即通用载体系统的构建；S2、利用高效piggyBac转座系统建立稳转细胞系株、有关转基因动物以及在基因治疗领域的潜在应用。本发明的方法将现有的piggyBac转座子进行改造提高其整合基因组的能力，不但整合编辑工具效率高，而且只需构建一种载体即可整合到宿主细胞的基因组在不同位点，利于一次性高效地筛选到最佳整合位点的克隆；另外，还可以通过反向PCRreverse‑PCR技术鉴定出插入位点。本发明的方法由改进的piggyBac转座子介导基因整合的策略具有效率高、操作简单、位点易鉴定等优势。

主权项：1.一种由改进的piggyBac转座子介导的基因整合方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1、高效piggyBac转座系统的构建，即通用载体系统的构建：通用载体系统包含供体载体和辅助载体，其中，供体载体：包括PiggyBac转座子5’重复末端序列5’TR和3’重复末端序列3’TR，在5’TR和3’TR之间设有多克隆位点；辅助载体：包括改造后的PiggyBac转座酶编码基因EPbase，在EPbase的上游设有能提高翻译起始的元件、高效启动子，在其下游设有更加有效的终止转录的PloyA；S2、利用高效piggyBac转座系统建立稳转细胞系株、转基因动物以及将其在基因治疗中应用：1构建新型piggyBac介导的稳转细胞系的载体系统，将目的基因连同筛选标记基因譬如新霉素抗性基因表达框插入S1所示的的供体载体的多克隆位点，获得构建稳转细胞株的供体载体PB目的基因；然后再直接通过PCR从质粒MAhelppigA3上扩增得到PB转座酶PBase，组装入pcDNA3.1载体得到由广谱表达的启动子CMV驱动的PBase表达系统；并在PBase的3端或5端分别插入高效核定位信号肽SV40-NLS；2使用Lipofectamine2000将上述载体转染细胞以验证其效果；其中，细胞共分为4组：pcDNA3.1PB目的基因；pcDNA3.1-PBasePB目的基因；pcDNA3.1-5NLSPBasePB目的基因和pcDNA3.1-3NLSPBasePB目的基因；将3种CMV启动子驱动的PB转座酶表达载体分别和环形质粒形式的PB目的基因供体载体在质量比1∶2的比例下混合，分别得到pcDNA3.1-PBasePB目的基因，pcDNA3.1-5NLSPBasePB目的基因和pcDNA3.1-3NLSPBasePB目的基因这3种PB转座酶介导的转座系统进行细胞转染。

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