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申请/专利权人：天津科融中健生物科技有限责任公司

摘要：本申请公开了一种骨髓间充质干细胞的外泌体，以ELISA方法检测结果计，所述外泌体包含COLII、Cxcl9、VEGF‑A、ETS1、PDZK1、KDR、P‑KDR、CX26、CX30、CX31和CX31.1蛋白，所述外泌体不包含COLII、Cxcl9、VEGF‑A、ETS1和PDZK1相关核酸物质。进一步通过细胞试验证实了外泌体包含的上述细胞因子、促成骨分化以及血管形成的功能蛋白，具有促使成纤维细胞培养物软骨分化和血管形成的作用，提示该外泌体具有应用于医学填充、创面修复等领域的应用前景。

主权项：1.一种骨髓间充质干细胞外泌体的体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：获得骨髓间充质干细胞的工作种子细胞；第一传代培养：弃去所述工作种子细胞培养液中的培养基，加入PBS洗1次，替换为第一条件培养基，于37℃、5%CO2条件下培养48h，得到第一代细胞；所述第一条件培养基为含有5μM1-5-哇啉磺酰基-2-甲基哌嗪、2μM地塞米松、50μgmL抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠以及10%vvFBS的DMEMF12培养液；第二次传代培养：将所述第一次传代培养得到的第一代细胞用PBS清洗1~2次，充分去除其中所述第一条件培养基后，并调整细胞浓度至106细胞数1mL的悬液后，接种至含有80mL第二条件培养基的细胞培养瓶中，于35℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养72h，每24h换液一次，得到第二代细胞；所述第二条件培养基为含有10μM4-甲基-5-{[2S-2-甲基-1,4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、5μM6-环辛基氨基喹啉-5,8-二酮、8ngmL转化生长因子-β以及10%vvFBS的DMEMF12培养液；第三传代培养：将第二次传代培养得到的第二代细胞用PBS清洗1~2次，充分去除其中第二条件培养基后，并调整细胞浓度至106细胞数1mL的悬液后，接种至含有80mL第三条件培养基的细胞培养瓶中，于35℃、饱和湿度、5%CO2、2%O2条件下培养48h，每24h换液一次，得到第三代细胞；所述第三条件培养基为1μM4-甲基-5-{[2S-2-甲基-1,4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、50ngmL转化生长因子-β、100ngmL肝细胞生物因子、200ngmL低氧诱导因子1α以及10%vvFBS的DMEMF12培养液；以及分离外泌体：将经过上述第三传代培养的细胞培养液，用于无菌PBS洗涤后，经300×g、10min；2000×g、10min和10000×g、30min的离心程序进行差速离心后；再次100000×g离心70min，得沉淀用PBS重悬，以得到所述外泌体。

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百度查询： 天津科融中健生物科技有限责任公司 骨髓间充质干细胞的外泌体、体外培养方法以及应用