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申请/专利权人：重庆医科大学国际体外诊断研究院

摘要：在本专利中，我们提出了一种基于AuPdCe@PCNs和3D双核DNA纳米机器的cfDNA电化学传感器。PCNs@AuPdCe表现出显著的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶样活性，并可作为信号标签。DNA纳米机器是以cfDNA和8腿PAMAM‑H1为驱动力而磁珠作为3D轨道设计的，能够实现从1到8到N的高度稳定的级联扩增，可切割释放大量连接子，以便捕获更多的AuPdCe@PCNs探针。得益于AuPdCe@PCNs和3D双核DNA纳米机器的双重放大，所建立的传感器表现出1fM‑1nM的良好线性关系，检测限低至84aM。因此，所提出的生物传感器在cfDNA相关的基础研究和临床诊断中具有广阔的应用前景。

主权项：1.基于AuPdCe@PCNs和3D双核DNA纳米机器的cfDNA电化学传感器，其制备方法包括以下步骤：1AuPdCe@PCNs的合成：首先通过热溶剂法制备PCNs，将25mg卟啉、700mg苯甲酸和75mg二氯化锆氧化物均匀分散在30mLN，N-二甲基甲酰胺DMF中，90℃条件下加热并搅拌1小时，之后将其冷却至25℃，15000rpm离心5分钟以收集制备的PCNs，并用DMF洗涤三次备用，随后制备AuPdCe@PCNs，将上述制备的1mLPCNs与1mL甲醇4℃混合12h，用去离子水洗涤3次以除去有机溶剂，在冰浴条件下将PCNs分散在30mL水中，并分别加入1μL浓度为1M的HAuCl4、PdCl2和CeNO33·6H2O连续搅拌30min，向混合物中滴加200μL浓度为10mgmLNaBH4溶液，并连续搅拌1h，最后用去离子水洗涤3次备用。2信号探针的制备：将1毫升0.1mgmLPCNs@AuPdCe水溶液与100.1MμLSP混合，并将混合物在4℃下搅拌12h。通过离心富集产物，随后用去离子水洗涤以除去未结合的PCNs@AuPdCe，用1mL1％BSA重悬，并在37℃下孵育30分钟，通过离心8000rpm，5min纯化信号探针，并用超纯水洗涤三次，分散在pH7.4的1×TE缓冲液中。3核酸外切酶III驱动的3D双核DNA纳米机器的构建：为确保发夹二级结构的稳定，在反应之前将每种探针在95℃加热5分钟，将PAMAM-H1复合物、修饰H2的磁珠和5U核酸外切酶III在反应缓冲液，4.41gLC6H5Na3O7，8.76gLNaCl，pH7，中与不同浓度的靶标混合，在37℃下孵育1小时以获得稳定的扩增产物。4cfDNA的检测：将10μL扩增产物和10μL构建好的信号探针先后滴加在电极上，分别在37℃下孵育30分钟，孵育完成后，利用三电极系统在含有20mMH2O2的10mL磷酸盐缓冲液中进行测量，电压范围为-1.5至0.6V，电压幅度为0.05V。

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