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申请/专利权人：中国科学院重庆绿色智能技术研究院

摘要：本发明属于电化学生物传感器技术领域，公开了电化学DNA传感器、制备方法及其应用。本发明的电化学DNA传感器是基于共价有机框架COFs和三酶反应的电化学生物传感器，本发明用COFAuPt构建电极，通过DSN的特异性切割与COFAu四面体‑HRPG4Hemin结构的信号放大作用，实现对circRNA的检测；本发明的传感器具有高特异性、高灵敏度、高准确性、高稳定性，实时快速，操作快捷成本低廉的优点，其可被用于人类血清样品的检测，为癌症和相关疾病的早期检测提供了新的方向和出路。

主权项：1.电化学DNA传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：合成circRNA用于合成circRNA的线性RNA的序列见SEQIDNO.1，在线性RNA的5’末端带有PO4修饰；S2：获得DNA2利用DNA1探针和Fe3O4溶液制备反应溶液一，之后将步骤S1中获得的10μL1μMcircRNA加入反应溶液一中，于室温下反应6h，再加入0.2UDSN在37℃下反应1h，之后通过磁分离的方式去除仍与Fe3O4连接的片段，剩下的即为DNA2；其中DNA1探针的序列见SEQIDNO.2，在DNA1探针的3’末端修饰有生物素；S3：合成DNA四面体-HRP准备四条DNA链溶液，每条链取2μL加入离心管，再加40μL杂交缓冲溶液，制备得到浓度为20μM的DNA探针混合物，随后利用DNA探针混合物合成浓度为1μM的DNA四面体探针工作液；随后将修饰有生物素的DNA四面体探针与链球菌修饰的浓度为1mgmL的HRP反应12h，得到DNA四面体-HRP，于4℃条件下保存备用；上述四条DNA链分别为DNAA、DNAB、DNAC和DNAD，序列分别见SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，其中：DNAB的5’末端修饰有生物素，DNAC的5’末端修饰有生物素，DNAD的5’末端修饰有生物素；S4：合成COFAuDNA4DNA5G4Hemin向制备得到的10mgCOF中加入1mL质量分数为1wt％的HAuCl4和8mL质量分数为1wt％的柠檬酸钠，柠檬酸钠原位还原后，AuNPs被负载在COF表面，收集所得产物，于10000rpm离心5min，用乙醇和水处理多次后，获得COFAu溶液，向COFAu溶液中加入DNA4和DNA5，通过缩合反应获得生物复合材料COFAuDNA4DNA5；之后将生物复合材料COFAuDNA4DNA5与步骤S3中获得的DNA四面体-HRP在K+和Hemin水浴中杂交形成COFAuDNA4DNA5G4Hemin；上述DNA4和DNA5的序列分别见SEQIDNO.7和SEQIDNO.8，其中：DNA4的3’末端修饰有HS-CH26；DNA5的5’末端修饰有HS-CH26；S5：修饰得到电化学DNA传感器用丙酮、乙醇和水依次清洗Au电极，并在N2流下干燥，之后在Au电极中滴入10μL1mgmLCOF溶液，然后将电极浸入含有10mMHAuCl4、10mMH2PtCl6和0.5MH2SO4的超纯水溶液中进行电沉积；之后在杂交缓冲液中加入DNA3，其中杂交缓冲溶液的组成与步骤S3中的杂交缓冲溶液的组成相同，将DNA3在4℃下过夜杂交至经电沉积后的Au电极表面，并通过特定的Au-S键固定在Au电极表面；随后将DNA3修饰的Au电极进一步用MCH处理2h，然后用PBS缓冲液洗涤以去除非特异性吸附的DNA；在杂交缓冲液中加入步骤S2中获得的DNA2，其中杂交缓冲溶液的组成与步骤S3中的杂交缓冲溶液的组成相同，用含有DNA2的杂交缓冲液于4℃条件下孵育经MCH处理之后的Au电极2h，用PBS和超纯水彻底冲洗后，将步骤S4中合成的COFAuDNA4DNA5G4Hemin移于连接有DNA2的Au电极上，于4℃孵育30min，然后分别用PBS和超纯水冲洗电极，即得电化学DNA传感器；上述DNA3的序列见SEQIDNO.9，DNA3的5’末端修饰有HS-CH26。

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