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一种Taq DNA聚合酶突变体及其筛选方法 

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申请/专利权人:浙江大学杭州国际科创中心;北京全式金生物技术股份有限公司

摘要:本发明公开了一种TaqDNA聚合酶突变体及其筛选方法,该TaqDNA聚合酶突变体与未经改造的野生型Taq酶相比,特异性和活性均有明显的提高,可极大程度满足研究和医学诊断应用需求。本发明还公开了一种改进后的CSR方法,简化了乳化过程和回收ePCR产物过程,使得目前操作步骤繁琐的CSR更简化;而且摒弃之前的方法中使用氯仿、苯酚和异丙醇的有毒有害试剂,让过程更环保和容易操作。

主权项:1.一种筛选得到TaqDNA聚合酶突变体的分隔式自我复制方法,其特征在于,包括以下步骤:1构建饱和突变文库:以含有TaqDNA聚合酶的环状质粒作为模板,进行PCR扩增,构建TaqDNA聚合酶定点饱和突变质粒文库;所述环状质粒的PCR体系为:模板1μL,引物F10μM1μL,引物R10μM1μL,dNTP2.5mM4μL,高保真酶缓冲液5μL,高保真酶1μL,补水至50μL的反应体系;引物F的序列为GCCGCCGTTATGTACCGNNKCTGGAAGCTCGCG;引物R的序列为AACGCGAGCTTCCAGMNNCGGTACATAAC;PCR热循环条件为:94℃预变性3min,94℃变性30s,Tm-5℃退火20s,72℃延伸4min20s,4℃保温;进行PCR扩增35个循环;2突变体文库的诱导表达:将步骤1获得的定点饱和突变质粒转入大肠杆菌细胞中,进行诱导表达,得到菌悬液;3乳化PCR:配制ePCR预混液,将ePCR预混液加入至CSR油相中,并在乳化过程中,向混合物中放入橡胶颗粒,得到单相的乳白色粘稠的乳液;ePCR预混液的配方为:10×PCRbuffer40μL,dNTP2.5mM40μL,2CSR-F8μL,2CSR-R8μL,菌体0.5OD,ddH2O304μL;2CSR-F的序列为:GCGGCAAAAACCATCAACTTCGGTGTTC;2CSR-R的序列为CTCCAGCGGTACCGCAAGTGGGTAGAC;4乳化PCR产物回收与扩增:采用PCR产物回收试剂盒回收乳化的PCR产物,并进行扩增反应;5连接转化与测序,得到TaqDNA聚合酶突变体;所述TaqDNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示;编码TaqDNA聚合酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

全文数据:

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