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申请/专利权人：武汉天晴干细胞有限公司

摘要：一种诱导性多能干细胞分化为成纤维细胞的方法，本发明的目的是要解决现有成纤维细胞获取的局限性。诱导性多能干细胞分化为成纤维细胞的方法：一、将PEG8000溶于无菌缓冲液中，消毒处理后向培养后的iPSC上清液中加入贮存液，得到iPSC外泌体；二、当培养第15～25代的诱导性多能干细胞生长到融合85％～90％，更换成分化培养基Ⅰ，得到初步分化的细胞；三、采用分化培养基Ⅱ重悬细胞，在37℃、体积浓度为5％CO2培养箱中培养；四、当培养至细胞融合至45～55％，更换成分化培养基Ⅲ，继续培养。本发明通过两步诱导方法将诱导性多能干细胞分化为成纤维细胞，优化培养条件和培养基成分，可获得足量的成纤维细胞。

主权项：1.诱导性多能干细胞分化为成纤维细胞的方法，其特征在于该诱导性多能干细胞分化为成纤维细胞的方法按照以下步骤实现：一、诱导性多能干细胞外泌体制备：a、当培养第20～30代的诱导性多能干细胞融合至45％～55％时，更换完全培养基继续培养，收集得到培养后的iPSC上清液；b、将PEG8000溶于无菌PBS缓冲液中，消毒处理后配制得到质量浓度为45％～55％的贮存液，向培养后的iPSC上清液中加入贮存液，充分混匀后于4℃下静置，再经离心，吸除上清液，沉降得到iPSC外泌体；二、当培养第15～25代的诱导性多能干细胞生长到融合85％～90％，更换成分化培养基Ⅰ，成分化培养基Ⅰ中加入iPSC外泌体，所述的成分化培养基Ⅰ为DMEMHIGH+14～16vol％FBS+1.5～2.5vol％iPSC外泌体，置于37℃、体积浓度为5％CO2培养箱中培养14～16天，得到初步分化的细胞；三、用Tryple消化初步分化的细胞，然后采用分化培养基Ⅱ重悬细胞，分化培养基Ⅱ中加入iPSC外泌体，所述的分化培养基Ⅱ为DMEMLOW+8～12vol％FBS+0.8～1.2vol％iPSC外泌体，接种在细胞培养板上，转移至37℃、体积浓度为5％CO2培养箱中培养；四、当步骤三培养至细胞融合至45～55％，更换成分化培养基Ⅲ，所述的成分化培养基Ⅲ为DMEMHIGH+5vol％FBS+15ngmL转化生长因子β1+20ngmLbFGF+1vol％ITS+0.1μmolL地塞米松，置于37℃、体积浓度为5％CO2培养箱中培养，得到成纤维细胞。

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