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申请/专利权人：集美大学;厦门医学院

摘要：本发明提供了一种基于理性设计改造的κ‑卡拉胶酶突变体及其制备方法，该方法利用AutoDock和PyMOL软件工具进行蛋白质底物结合分析及蛋白结构显示，结合Hole分析预测κ‑卡拉胶酶催化活性提高的突变位点，再结合序列保守性分析筛选鉴定得酶活提高突变体I149F；将野生型κ‑卡拉胶酶在其I149F的突变位点进行突变，产生κ‑卡拉胶酶突变体。该方法可提高酶的催化活性，突变酶的酶活力提高约107％；在45℃处理30min后，与野生型κ‑卡拉胶酶相比，突变酶的残余活力比野生型酶高出15％左右，从而使该酶活提高κ‑卡拉胶酶在卡拉胶寡糖工业生产中具有良好的应用前景。

主权项：1.一种基于理性设计改造的κ-卡拉胶酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、酶的三维结构建模:将野生型κ-卡拉胶酶Pcar16及该酶突变体N205C-G239C的氨基酸序列输入AlphaFold2，对酶的三维结构进行预测，运行结束后，生成得到相关文件；S2、酶构象合理性评估:对S1步骤获得的模型使用SAVESv6.0评分程序对蛋白质构象合理性进行评估，选择模型进行后续实验；S3、蛋白与底物进行分子对接：利用AutoDock软件工具将步骤S2获得的野生型κ-卡拉胶酶Pcar16及突变体N205C-G239C模型分别进行蛋白质底物结合分析、用PyMOL软件进行蛋白结构显示；S4、底物通道分析：将步骤S3得到的分子对接结果进行Hole分析，野生型κ-卡拉胶酶Pcar16与突变体N205C-G239C的底物通道叠合，寻找通道宽窄差别明显的点位列为待突变的位点。S5、氨基酸保守性分析:将野生型蛋白酶的结构模型或氨基酸序列提交至Consur服务器运行，进行筛选，将步骤S4筛选到的突变位点与该结果结合，选择非高度保守的残基进行突变获得突变文库，筛选出酶活提高最佳的突变位点I149F；S6、将野生型κ-卡拉胶酶Pcar16在其I149F的突变位点进行突变，产生κ-卡拉胶酶突变体。

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