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申请/专利权人：广东一方制药有限公司

摘要：本发明公开了一种用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒PCR鉴别的引物组合，其包括引物一和引物二，其中，引物一为核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的DNA分子，引物二为核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的DNA分子。本发明还公开了上述引物组合的应用，以及基于该引物组合的鉴别方法。实施本发明，可有效鉴别乌梢蛇药材、标准汤剂以及中药配方颗粒。

主权项：1.一种乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂及乌梢蛇中药配方颗粒的PCR鉴别方法，其特征在于，包括：取待检测样品0.3～0.8g，研磨成粉末，置离心管中，加入1～1.8mL的CTAB沉淀液、15～25μL蛋白酶K，混合均匀，在60～70℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；加入800～1000μLCTAB沉淀液，15～25μL蛋白酶K，混合均匀，在60～70℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；取沉淀加入800～1000μLCTAB提取液，5～15μLβ-巯基乙醇，混合均匀，在60～70℃下加热100～150min，离心，冷却至室温；取提取后上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，震荡混匀后离心，取上清液700～800μL，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，震荡混匀后离心，取上清液400～500μL，加入等体积的异丙醇或异丙醇-乙酸钠混合液，于-30～-20℃静置30～60min，离心后弃去上清液，再用乙醇洗涤沉淀2～4次，弃去上清液，沉淀于35～38℃孵育20～40min，待乙醇挥发后，加入30～50μL灭菌水溶解，即得到待检测样品的基因组DNA；其中，所述CTAB沉淀液的组成为：2％wvCTAB，100mmolLTris-HCl，20mmolLEDTA；所述CTAB提取液的组成为：2％wvCTAB，100mmolLTris-HCl，20mmolLEDTA，2.5molLNaCl，20％wvPVP40；其中，Tris-HCl、EDTA的pH均为8.0；以所述基因组DNA为DNA模板，采用核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的引物一、核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的引物二进行PCR扩增，若扩增产物中含有135bp的DNA片段，则待检测样品为乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂或乌梢蛇中药配方颗粒；其中，PCR扩增体系由下述物质组成：10×PCRBufferⅠMg2+plus2.5μL，dNTPMixture0.6μL，引物一0.3μL，引物二0.3μL，rTaq0.3μL，DNA模板1μL，去离子水20μL；PCR扩增程序为：将所述扩增体系在95℃预变性5min，然后在预设程序下循环35次，最后在72℃延伸5min；其中，所述预设程序为：将扩增体系在95℃变性30s，然后在59～61℃退火30s，再在72℃延伸30s。

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