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申请/专利权人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所

摘要：本发明公开了一种基于DNAzyme循环激活的循环肿瘤DNA检测方法，该方法中：末端修饰了二茂铁的探针A修饰于金电极表面，探针B‑C杂交体连接在探针A上，在目标核酸的驱动下可将探针C置换，使探针B末端修饰的亚甲基蓝信号分子靠近金电极表面，并通过激活DNAzyme催化探针A裂解释放二茂铁信号分子，游离的探针序列还能够进一步激活其他DNAzyme，从而放大信号，通过研究双信号的强度变化对比可实现对目标核酸的定量分析。本发明通过对目标循环肿瘤DNA触发的双重电化学信号变化的综合分析后能够实现循环肿瘤DNA浓度的超灵敏定量分析，且检测方法简单，易于操作，对循环肿瘤DNA特异性强，具有很好的应用前景。

主权项：1.一种核酸传感器，其特征在于，其包括DNA探针A、DNA探针B和DNA探针C，该核酸传感器用于检测ctDNA，检测方法包括：提供一条含有颈环结构且末端修饰了第一信号分子的DNA探针A，所述DNA探针A修饰于金电极表面；提供由不完全互补配对的DNA探针B与DNA探针C杂交得到的探针B-C杂交体，通过碱基互补配对原则使所述探针B-C杂交体连接在所述DNA探针A上，从而也固定于所述金电极表面，所述DNA探针B的末端修饰有第二信号分子；采用电化学检测方法，利用修饰有DNA探针A和探针B-C杂交体的金电极并结合激活DNAzyme的策略对目标ctDNA进行检测：当目标ctDNA存在时，目标ctDNA可置换所述探针B-C杂交体中的DNA探针C，并与DNA探针A、DNA探针B形成DNAzyme结构，使得DNA探针B末端修饰的第二信号分子靠近金电极表面，从而使得第二信号分子的信号强度增大；并通过激活DNAzyme催化DNA探针A的裂解，释放出第一信号分子，使得第一信号分子的信号强度降低，DNA探针A裂解后形成的游离的探针序列进一步激活其他DNAzyme，从而放大信号；最后通过电化学检测方法分析第一信号分子和第二信号分子的信号强度的变化，实现目标ctDNA的定量检测；所述第一信号分子为二茂铁，所述第二信号分子为亚甲基蓝；其中，通过向反应体系中加入辅酶因子来激活DNAzyme；其中，辅酶因子为Mg2+；该检测方法具体包括以下步骤：1）金电极预处理；2）DNA探针A的修饰：先配制电极固定液，再使用该电极固定液配制DNA探针A溶液，然后将预处理后的金电极插入DNA探针A溶液中修饰，之后洗净金电极，然后在巯基己醇中浸泡反应；该固定液包括：10mMTris-HCl、1mMEDTA、10mMTCEP和0.1MNaCl；3）目标ctDNA定量分析：分别配制DNA探针B溶液和与DNA探针C溶液，然后混合，得到的混合液先加热然后冷却至室温；将步骤2）得到的金电极浸泡到该混合液中反应，接着将金电极洗净后浸泡到待测得目标ctDNA溶液中反应，随后向目标ctDNA溶液中加入Mg2+，继续反应；对步骤3）反应前后的金电极进行电化学分析，通过预先制定的表征目标ctDNA浓度与金电极的电化学信号的强度变化关系的标准曲线计算得到目标ctDNA的浓度；所述目标ctDNA的序列为：5’-GTTGGAGCTAGTGGCGTAG-3’；所述DNA探针A的序列为：SH-TTTTCTACGCCACATATTCCAACCTATrAGGAAGAGATGACGTTGGAGCTAGTGGCGTAG-Fc；所述DNA探针B的序列为：TCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGGTTGGAGCTAGTGG-MB；所述DNA探针C的序列为：CATCGCCACTAGCTCCAACCTATTT。

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