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申请/专利权人：台州科技职业学院

摘要：本发明公开了一种筛选与纯化柑橘皮抗氧化活性成分的方法。所述方法是将干燥的柑橘皮用70％乙醇回流提取后减压蒸去溶剂得到乙醇粗提物，取定量的乙醇粗提物用纯水分散，分别与等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到各萃取层的浸膏。在96孔板中进行ABTS自由基清除实验，计算IC50值，确定抗氧化能力最好的活性层乙酸乙酯层。通过高效液相色谱和微馏分活性评价法确定乙酸乙酯层中的抗氧化活性峰，利用液液色谱筛选合适的两相溶剂体系分离该活性物质，最后通过制备型液相色谱纯化，得到芸香柚皮苷单体。本发明利用高效液相微馏分活性筛选与高速逆流色谱相结合的方法，分离柑橘皮中的抗氧化活性物质，目的性更强，且快速高效。

主权项：1.一种筛选和纯化柑橘皮抗氧化活性成分的方法，其特征在于，所述方法为：S1以干燥的柑橘果皮为原料，以料液比1:10的70％乙醇溶液经回流提取3次，每次回流提取时间2h，合并提取液，提取液趁热过滤、真空回收溶剂得到乙醇粗提物；S2乙醇粗提物用纯水分散，每10g乙醇粗提物用500mL纯水分散，后与等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取三次，合并萃取层，真空回收溶剂得到石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层浸膏；S3将石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层浸膏在96孔板中进行ABTS自由基清除能力试验，确定乙酸乙酯层为抗氧化能力最强的萃取层；S4将乙酸乙酯层经高效液相色谱分析，优化条件之后得到具有重复性的液相色谱图；优化条件之后的高效液相色谱条件为，流动相为乙腈A-水B溶液，梯度洗脱模式：0～15min，10％～16％A；15～55min，16％～30％A；55～65min，30％～60％A；65～80min，60％～85％A；流速：0.8mLmin；检测波长：280nm、254nm；进样量：20μL；经微馏分活性评价，确定有抗氧化活性的目标峰；S5利用液液萃取，目标分离物质在两相中的溶解度不同，筛选两相溶剂体系，使得需分离的目标化合物在两相溶剂体系中的分配系数为0.5～2最佳；两相溶剂体系为乙酸乙酯、正丁醇、水，体积比为3:2:5；S6利用步骤S5所筛选的两相溶剂体系进行高速逆流色谱分离，在分液漏斗中加入两相溶剂体系，振摇后静置分层，取上相作为液液色谱的固定相，下相作为流动相；S7取步骤S3所述乙酸乙酯层用步骤S6所述固定相和流动相溶解，得到样品溶液；所述固定相和流动相的体积相等，用量以柑橘皮萃取层样品的质量计为2mgml；S8取固定相注满液液色谱仪的分离柱，开启速度控制器，使分离柱正转，在500～1000rmin转速下，以2mLmin的流速注入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时将样品溶液由进样阀注入分离柱，波长280nm的紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，收集得到的洗脱液通过高效液相进行检测，合并含量最高化合物的洗脱液，减压蒸去溶剂后，经半制备色谱纯化分离得到芸香柚皮苷单体；步骤S8中高效液相的检测条件为：UfavourODS-C18column，250×4.6mm,5μm；柱温25℃；流动相为乙腈A-水B溶液，梯度洗脱模式：0～15min，10％～16％A；15～55min，16％～30％A；55～65min，30％～40％A；65～80min，40％～85％A，流速：0.8mLmin；检测波长：280nm、254nm；进样量：20μL。

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