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申请/专利权人：西北农林科技大学

摘要：本发明提供了一种草鱼成肌细胞的诱导分化方法，具体包括如下步骤：草鱼肌肉组织块的取样及消毒：取小块草鱼背肌组织块，移入装有含1％双抗PBS的离心管中；细胞的原代培养：组织块经灭菌、剪碎后加入生长培养基进行培养；细胞的传代培养：原代细胞覆盖率达到50％～60％时即可进行传代培养；冻存与复苏：细胞在‑80℃冰箱冻存；细胞的分化诱导：接种细胞至24孔板中，生长培养基培养24h，细胞铺满底层后更换生长培养基为分化培养基。本发明为淡水鱼类肌肉生长相关基因的功能验证及生长发育调控机理的研究提供基础实验材料，为开发促生长的功能性营养饲料提供研究材料及技术支持，为解决草鱼肌肉松软、质地和口感欠佳的问题提供理论基础。

主权项：1.一种草鱼成肌细胞的诱导分化方法，其特征在于：所述方法具体包括如下步骤：1草鱼肌肉组织块的取样及消毒：取小块草鱼背肌组织块，移入装有含1％双抗PBS的10mL离心管中；2细胞的原代培养：将组织块从离心管移到含1％双抗PBS的小烧杯中，浸泡2～3min，使组织块和PBS充分接触，重复三次，灭菌完成后将组织块剪为1mm3，将剪碎后的组织块接种于六孔板，倒置于培养箱中干贴4h，随后将六孔板正放并加入生长培养基，每两天更换一次；3细胞的传代培养：原代细胞生长到50％～60％时进行首次传代，传代的所有细胞仍在原六孔板中培养，至细胞覆盖率达到80％～90％时再次进行传代，一孔传两孔，三代后，3～4个孔细胞传至一个细胞培养瓶中；4冻存与复苏：细胞的冻存：步骤3中的细胞长满培养瓶后，去除培养基，加入1mL胰酶消化，待细胞收缩变圆后去除消化液，加入2mL生长培养基终止消化，移液枪轻轻吹散，悬起细胞，随后转移至10mL离心管中，1500rmin离心5min，弃上清，加入1mL细胞冻存液，轻轻吹散、混匀，转移至冻存管中；将冻存管放入梯度冻存盒中，-80℃冰箱中保存；细胞的复苏：自-80℃冰箱中取出保存的冻存管，迅速置于37℃水浴中，轻轻晃动冻存管，直至冻存管中只剩下绿豆大小冰块时停止水浴，将冻存液迅速转移至装有2mL生长培养基的10mL离心管中，1500rmin离心5min，弃上清，加入4mL生长培养基重悬细胞，混匀，接种至培养瓶中，培养箱中培养，待细胞长成单层后可进行传代培养；5细胞的分化诱导：接种细胞至24孔板中，生长培养基培养24h，细胞铺满底层后更换生长培养基为分化培养基，此时记为分化第0天，每两天更换一次分化培养基，进行相关细胞实验。

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