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申请/专利权人：湘湖实验室(农业浙江省实验室)

摘要：本发明涉及一种牛月形单胞菌分离培养方法，属于微生物技术领域，包括以下步骤：A1、基于瘤胃插管技术进行瘤胃液采集；A2、培养前的材料制备与准备工作；A3、牛月形单胞菌的分离；A4、利用常规细菌接种法进行生化试验；A5、菌株16SrDNA基因序列鉴定。本发明技术方案中，基于反刍动物瘤胃液采用厌氧分离技术从奶牛瘤胃中分离培养牛月形单胞菌，通过对其形态观察、培养条件、底物特性、生理生化特性、16SrRNA基因序列分析、同源性分析等手段，确定分离菌株，为靶向分离瘤胃来源牛月形单胞菌提供技术手段。

主权项：1.一种牛月形单胞菌分离培养方法，其特征在于：包括以下步骤：A1、基于瘤胃插管技术进行瘤胃液采集；A2、培养前的材料制备与准备工作；A3、牛月形单胞菌的分离；A31、将瘤胃液于37℃迅速送回实验室在600rmin下离心10min，以去除瘤胃液中的饲料颗粒及纤毛虫等微生物，取上清液，用生理盐水梯度稀释，然后各取50μL不同梯度的稀释液用L棒均匀涂布于固体培养基中，在厌氧工作站或用厌氧培养袋在39℃条件下培养48h，取单个40μL菌落在新鲜LB固体培养基上划线，纯培养，并进行专性厌氧杆菌营养液的液体培养，在厌氧工作站中在37℃下恒温培养48h，再进行革兰氏染色镜检；A32、称取PYG培养基基础18.04g，加热溶解于500mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min后，冷却至50℃，加入过滤除菌的维生素K1溶液、5mgmL血红素溶液，以及灭菌瘤胃液、马血清和二柳苏糖醇，使用8MNaOH将pH值调整至7.2，混匀备用；菌株保藏，将单个菌落接种于新鲜的液体全营养培养基，在厌氧培养箱中过夜，然后取菌液加入到灭菌甘油中，使用厌氧培养箱于37℃条件下培养48h，接着无菌条件下加入2mL细菌悬液至营养肉汤中，将细菌和肉汤混匀使细菌最终浓度为108-109cellmL；基于冻干法在无菌条件下将细菌分装到有灭菌玻璃珠的冷冻管中，反复吹打，使珠子内部的气泡完全被细菌悬液替代，吸去冷冻管内多余的液体，将混有细菌和珠子的冷冻管放入-80℃冰箱保存；A4、利用常规细菌接种法进行生化试验：以多糖、二糖或单糖作为唯一碳源底物，进行Bioscreen全自动微生物生长曲线分析以及生长动力参数分析，获得牛月形单胞菌可代谢的碳源底物谱，在此基础上对牛月形单胞菌所有可代谢碳源进行软琼脂平板趋化试验和毛细管趋化试验以测定细菌趋化性，确定使牛月形单胞菌产生正向趋化的特异性碳水化合物底物；A5、菌株16SrDNA基因序列鉴定。

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