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申请/专利权人：哈尔滨医科大学附属第一医院

摘要：基于框架核酸的miRNA‑21递送系统及其在角膜上皮损伤修复中的应用，涉及基于框架核酸的miRNA‑21递送系统的应用技术。本发明的目的是为了提供安全且高效的基因递送载体，优化miRNA递送效率以促进角膜上皮损伤的修复。基于框架核酸的miRNA‑21递送系统是由四面体DNA框架结构和miRNA‑21构成的纳米级核酸复合物。所述四面体DNA框架结构是由特定核酸序列的DNA单链自组装而成的微观3D立体四面体结构，其中一个顶点延伸出用于连接miRNA‑21的黏性末端。利用基于框架核酸的miRNA‑21递送系统递送miRNA‑21进入角膜上皮细胞。该纳米复合物结构稳定性较强，可在没有佐剂的情况下进入角膜上皮细胞，入胞效率高，提升靶细胞内miRNA‑21表达水平，并促进角膜上皮的增殖和迁移。在角膜上皮损伤修复中的应用中，经证明本发明对眼表组织无明显毒副作用，作为滴眼液，给药途径方便快捷，可促进角膜上皮损伤的修复。

主权项：1.一种用于促进角膜上皮损伤修复的基于框架核酸的miRNA-21递送系统，其特征在于，它是由四面体DNA框架结构和单链RNAssRNA组成的纳米级核酸复合物，基于框架核酸的miRNA-21递送系统简称T-21；所述四面体DNA框架结构是由特定核酸序列的单链DNA（ssDNA）自组装而成的微观3D四面体框架结构，其中一个顶点延伸出用于连接ssRNA的黏性末端；所述ssRNA通过碱基互补配对方式连接于四面体DNA框架结构的黏性末端，从而连接于四面体DNA框架结构上；在T-21结构中，作为载体的四面体DNA框架结构由S1、S2、S3’、S4四条DNA单链组成；DNA单链S3’是以S3单链序列为基础，延长其5’端核酸序列作为用于连接单链RNA的黏性末端，DNA单链S1、S2、S3、S4核酸序列等长；四条DNA单链依据碱基互补配对原则，经一步退火法折叠形成微观的3D四面体框架结构，其中DNA单链S3’中未结合的核酸序列自四面体一顶点延伸出来作为黏性末端，用于连接RNA单链S5和S6；各条单链的核酸序列如下表所示： ssDNA 方向 碱基序列 S1 5’→3’ ACGTATCACCGCCCATTCTAGAGGTTTCTACTGGGACTGCAGAGGGATATAGCTAAGTCTGTT S2 5’→3’ ACAACGTAGGGTCCATATTCCAGCATTTCAGCAATCTACTCGAAACAGACTTAGCTATATCCC S3 5’→3’ ACTAGAATGGGCGGTGATACGACGAGTAGATTGCTGAAATGCACGGAACTCGCATTCCCATGG S4 5’→3’ AGGAATATGGACCCTACGTTGACTGCAGTCCCAGTAGAAACCACCATGGGAATGCGAGTTCCG S3’ 5’→3’ TTGACCTGTGAATTACTAGAATGGGCGGTGATACGACGAGTAGATTGCTGAAATGCACGGAACTCGCATTCCCATGG S5 5’→3’ UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA S6 5’→3’ UUCACAGGUCAAUCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA 所述基于框架核酸的miRNA-21递送系统合成方法先经一步退火法合成四面体DNA框架结构（tFNAs’），后将tFNAs’与S5、S6室温孵育以最终合成T-21，具体步骤为：（1）制备含有10mMTris-HCl和50mMMgCl2的pH为8.0的TM缓冲液用于合成四面体DNA框架结构；通过自动DNA合成仪合成ssDNA及ssRNA，为减少ssDNA及ssRNA粉末损耗，将ssDNA及ssRNA离心管于4℃8000rpm离心10分钟，确保粉末聚集于试管底部，加入DEPC水溶解，配置为终浓度为100μM的工作液，于4℃条件下保存；（2）紫外线分光光度计进一步测定各ssDNA工作液在260nm波长处的光吸收值，根据以下公式进一步计算出100μL，2μM体系中各单链的总体积：V=2×100[（A260）×105（15.2×单链中腺嘌呤数目+7.4×单链中胞嘧啶的数目+11.4×单链中鸟嘌呤的数目+8.3×单链中胸腺嘧啶的数目）]；（3）根据上述计算结果，分别吸取步骤（2）中相应ssDNA单链的总体积数，加入TM工作液中，漩涡振动，充分混匀；预热热循环仪，设置热循环仪程序：温度95℃，变性10分钟，随后快速冷却至4℃，持续30分钟，获得tFNAs’母液；（4）将S5、S6工作液加入至tFNAs’母液中使其终浓度为2μM，室温下孵育2小时以获得T-21纳米结构。

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