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申请/专利权人：天津国科医疗科技发展有限公司;中国科学院苏州生物医学工程技术研究所

摘要：本发明公开了一种基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，包括以下步骤：1干血斑样本前处理：1‑1萃取：从干血斑样本上取血片，加入内标萃取液，震荡；1‑2氮吹：离心，然后氮吹干；1‑3衍生：加入含盐酸羟胺的乙腈水溶液，混匀，然后恒温衍生，制得测试样；2采用液相色谱串联质谱的方法对测试样进行检测，通过标准曲线计算得到待测干血斑样本中的12种类固醇激素的含量。本发明采用的干血斑采样具有极小的侵入性、样品采集简便，可以有效去除生物样本的基质效应，干血斑的运输和储存便利；本发明通过羟胺衍生可以提高羰基类固醇激素的离子化效率，通过流动相中加入氟化铵可以改善羟基类固醇的电离过程。

主权项：1.一种基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1干血斑样本前处理：1-1萃取：从干血斑样本上取血片置于容器中，加入内标萃取液，震荡；1-2氮吹：离心，然后氮吹干；1-3衍生：向步骤1-2得到的产物中加入含盐酸羟胺的乙腈水溶液，混匀，然后恒温衍生，制得测试样；2采用液相色谱串联质谱的方法对测试样进行检测，通过标准曲线计算得到待测干血斑样本中的12种类固醇激素的含量；其中，所述12种类固醇激素包括：双氢睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、皮质酮、可的松、雌酮、雌二醇、雌三醇、17-羟孕烯醇酮、醛固酮和雄烯二酮；所述步骤1具体包括：1-1萃取：从干血斑样本上取若干个血片置于离心管中，加入内标萃取液，室温下300-1500rpm下震荡20-80min；1-2氮吹：2500-10000rpm下离心2-10min，得到提取液，然后将提取液转移到新的离心管中，然后氮吹干除去溶剂；1-3衍生：向步骤1-2得到的产物中加入含50-200mM盐酸羟胺的乙腈体积分数为15-60％的乙腈水溶液，300-1500rpm下混匀0.5-2min，然后在40-70℃下恒温衍生15-60min，制得测试样；其中，液相色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅胶填料柱；流动相：A相为0.2mM的氟化铵水溶液，B相为0.2mM的氟化铵甲醇溶液；梯度洗脱程序：初始，40％B；0-4min，60％B；4-5.7min，67％B；5.7-8.3min，70％B；8.3-8.5min，90％B；8.5-11.3min，90％B；11.3-11.5min，40％B；11.5-13min，40％B；流速：0.7mLmin；进样量：10μL；柱温：40℃；质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；检测方式：多反应监测；气帘气30psi，喷雾气50psi，辅助加热气60psi，温度500℃，离子化电压：+5500V-4500V，碰撞气：10psi；其中，内标萃取液的制备方法为：将双氢睾酮-13C3、雄烯二酮-13C3、脱氢表雄酮-13C3、17-羟孕酮-13C3、孕酮-13C3、皮质酮-d8、可的松-13C3、雌酮-13C3、雌二醇-d4、雌三醇-d3、17-羟孕烯醇酮-d213C2、醛固酮-d8混合并通过甲醇稀释得到内标萃取液，内标萃取液中双氢睾酮-13C3、雄烯二酮-13C3、脱氢表雄酮-13C3、17-羟孕酮-13C3、孕酮-13C3、皮质酮-d8、可的松-13C3、雌酮-13C3、雌二醇-d4、雌三醇-d3、17-羟孕烯醇酮-d213C2、醛固酮-d8的浓度依次为75ngmL、100ngmL、1500ngmL、100ngmL、1000ngmL、100ngmL、500ngmL、15ngmL、50ngmL、200ngmL、1μgmL和60ngmL；其中，干血斑样本包括待测干血斑样本和用于构建标准曲线的干血斑标准曲线样本；其中，待测干血斑样本的制备方法为：用移液器吸取待测血液样品滴于滤纸片采样圈的中心位置，然后将滤纸片在室温下正面朝上自然晾干，即得干血斑样本；干血斑标准曲线样本的制备方法包括以下步骤：S1、制备人造空白全血：S1-1、使用肝素抗凝全血，以3000rpm的速度离心5min，弃去上层血浆后，加入等体积生理盐水溶液，充分混匀清洗后；S1-2、再次以3000rpm离心5min，吸取并丢弃上层清液，重复此操作5次，即得红细胞；S1-3、将红细胞与去激素人血清按照55:45比例混合，混匀后即得人造空白全血；S2、制备全血标准曲线溶液：取标准品双氢睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、皮质酮、可的松、雌酮、雌二醇、雌三醇、17-羟孕烯醇酮母液、醛固酮和雄烯二酮母液用甲醇进行稀释得到标准溶液，将标准溶液加入到人造空白全血中配制得到一系列浓度的全血标准曲线溶液；S3、制备干血斑标准曲线样本：用移液器吸取全血标准曲线溶液滴于滤纸片采样圈的中心位置，然后将滤纸片在室温下正面朝上自然晾干，即得干血斑标准曲线样本；通过将血斑标准曲线样本按照所述步骤1进行前处理后，再供液相色谱串联质谱的方法进行检测，构建得到标准曲线。

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