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申请/专利权人：河南大学

摘要：本发明属于分子生物学和生物工程技术领域，具体涉及一种酿酒酵母整合表达载体及其构建方法。本发明通过将酿酒酵母基因组中的δ序列与YEplac181质粒上的AmpR抗性基因、多克隆位点、Leu标签、Ori复制子的DNA序列，以及引入特殊的限制性内切酶SbfI识别位点构建成一个质粒。本发明在质粒线性化过程中相对于其他酿酒酵母整合载体，能够极大程度避免插入的外源基因被切割，大大降低了载体对插入外源基因或转录单元碱基序列的限制性。引入的YEplac181的MCS区域，多达16种常见的限制性酶切位点使得此载体相对于其他同类型载体，对外源基因或者转录单元片段的插入更具有简便性。本发明的构建方法简单快捷，具有较好的应用前景。

主权项：1.一种酿酒酵母整合表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（一）提取酿酒酵母基因组DNA取冷冻的酿酒酵母菌液，室温融解，以1:50~1:100的比例接种至培养基中，过夜培养，收集菌体提取基因组DNA；（二）提取YEplac181质粒取冷冻的含质粒YEplac181菌的菌液，室温融解，以1:50~1:100的比例接种至培养基中，过夜培养，收集菌体提取质粒DNA；（三）设计引物设计引物对，包括：5’δ-F、5’δ-R引物对和3’δ-F、3’δ-R引物对；AmpR-P-F、OriR-R引物对，Lac-p-F、Leu-P-R引物对；（四）PCR扩增5’δ-F、5’δ-R引物对、3’δ-F、3’δ-R引物对以步骤（一）提取的酿酒酵母基因组DNA为模板，经PCR扩增获得5’δ、3’δ片段；AmpR-P-F、OriR-R引物对，Lac-p-F、Leu-P-R引物对以YEplac181质粒为模板，经PCR扩增获得相应的片段；（五）一步克隆连接将步骤（四）扩增后的片段通过一步克隆试剂盒连接成一个完整的环形质粒；（六）转化、筛选和鉴定将步骤（五）的环形质粒转化进大肠杆菌感受态细胞中，然后涂布于含Amp抗生素的固体平板上，过夜培养；生长出的菌落用3’δ-F、5’δ-R引物对和Leu-P-R、Lac-p-F引物对进行菌落PCR鉴定，挑取单菌落经液体LB培养基过夜培养提取质粒；（七）二次PCR扩增以步骤（五）获得的环形质粒为模板，用LacZa-F’、LacZa-R’引物对扩增获得一个新的片段；（八）二次一步克隆连接将步骤（七）获得的片段通过一步克隆试剂盒连接成一个完整的环形质粒；（九）二次转化、筛选和鉴定将步骤（八）的环形质粒转化进大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含Amp抗生素的LB固体平板上，过夜培养；生长出的菌落用3’δ-F、5’δ-R引物对和Leu-P-R、Lac-p-F引物对进行菌落PCR鉴定，并测序验证，确保质粒序列正确。

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