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申请/专利权人：南京广祺医药科技有限公司

摘要：本发明公开了一种同时定量测定血浆中槲皮素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖醛酸苷、山柰酚‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖醛酸苷和秦皮乙素的方法及应用，采用直接蛋白沉淀法，经离心后进样测定，通过分析物的标准曲线得出血浆中分析物的浓度或含量。本发明提供的同时定量测定血浆中槲皮素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖醛酸苷、山柰酚‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖醛酸苷和秦皮乙素的方法及应用，利于高通量处理样本，无毒害，操作安全；具有良好的特异性、灵敏度、精密度和准确度，血浆基质不影响分析结果，样品消耗量少，前处理过程简单、经济、快速，分析时间短，分析效率高，提取回收率高，可用于含有槲皮素类、山奈酚类及秦皮乙素有效成分的中药材和中药方剂的现代化开发。

主权项：1.一种血液中同时测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和秦皮乙素的方法，其特征在于包括以下步骤：步骤S1，液质联用仪参数设定（1）色谱条件参数设定如下：流动相A：2mM甲酸铵与0.5%甲酸的混合水溶液；流动相B：体积比为1:1的甲醇和乙腈混合液；色谱柱型号：AglientZORBAXSB-C8；色谱柱尺寸规格：2.1×100mm；填料粒径：3.5μm；流速：0.8mLmin；柱温：40℃；自动进样温度：4℃；进样量：8μL；分析时间：6min；梯度洗脱参数： ，（2）质谱条件参数设定如下：离子化模式：电喷雾离子化下的负离子模式；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的离子对：母离子477.1Da→碎片离子301.1Da；山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的离子对：母离子461.1Da→碎片离子285.2Da；秦皮乙素的离子对：母离子176.8Da→碎片离子105.0Da；葛根素的离子对：母离子415.1Da→碎片离子295.1Da；离子源参数：喷雾气=60psig，辅助加热气=60psig，喷撞气=9psig，气帘气=35psig，离子源加热温度=550℃，离子化电压=-3500V，射入电压=-10V，碰撞室射出电压=-10V；步骤S2，样品前处理空白血样和待测血样均按以下方法进行处理：全血采集后，立即加入占全血体积2.5%的含1molL抗坏血酸及0.72molL柠檬酸的水溶液；采集的全血进行处理得到血浆，得到的血浆立即加入占血浆体积5%的含2%ww甲酸和1molL抗坏血酸的水溶液；最终得到处理后的空白血样和待测血样；步骤S3，分析物储备液的制备分别精确称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和秦皮乙素，并置于螺口瓶中，用DMSO溶解定容，分别得到浓度均为1mgmL的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和秦皮乙素的储备液，备用；步骤S4，分析物标准曲线工作液的制备分别量取步骤S3得到槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和秦皮乙素的储备液，以甲醇为溶剂，按逐级稀释配制得到不同的已知浓度的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和秦皮乙素工作液，作为标准曲线工作液，并于2-8℃下保存备用；同样的，按上述方法得到另一组已知浓度的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和秦皮乙素工作液，作为质控工作液，并于2-8℃下保存备用；步骤S5，内标工作液的配制将葛根素固体以DMSO或甲醇溶解并定容，得到1mgmL的葛根素内标储备液，并于-65℃以下温度保存，备用；使用时，取葛根素内标储备液，用稳定溶剂稀释制备得到目标浓度的内标工作液，并于2-8℃下保存备用；所述稳定溶剂为在体积比1:1甲醇和乙腈的混合液中，加入占所述混合液体积0.1%的甲酸组成的混合液；步骤S6，首先，将步骤S2经过处理后的空白血样分成标准曲线工作液组和质控工作液组，所述标准曲线工作液组和质控工作液组分别加入步骤S4得到的不同已知浓度的标准曲线工作液和质控工作液，从而得到不同已知浓度的标准曲线样品和质控样品；然后，取40.0μL的标准曲线样品、质控样品和待测血样，分别加入200μL步骤S5制得的内标工作液，经过涡流振荡5min后，在4℃和4000rpm转速下离心10min，取上清液50μL，并送入步骤S1已经设定好参数的液质联用仪中进行测定分析，记录标准曲线样品、质控样品和待测血样的分析物和内标物峰面积；接着，以标准曲线样品中的分析物和内标物峰面积的比值，对理论浓度进行线性回归，得到的回归方程即为分析物标准曲线；最后，将记录得到待测血样的分析物和内标物峰面积的比值代入前述分析物标准曲线，从而得到待测血样中分析物的浓度。

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