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申请/专利权人：东北农业大学

摘要：本发明一种磁性纳米颗粒固定化磷脂酶的制备方法，属于磁性材料固定化酶技术领域；该方法包括以下步骤：1Fe3O4@SiO2@CS‑COOH磁性纳米颗粒的制备；2活化Fe3O4@SiO2@CS‑COOH磁性纳米颗粒；3将磷脂酶酶液加入已活化的磁性纳米颗粒悬浮液中；4将悬浮液置于恒温水浴摇床中进行固定化反应；5将悬浮液磁分离，得到磁性固定化酶。本发明利用磁性纳米载体表面修饰方法，对酶分子进行固定化处理和分子化修饰，得到磁性固定化酶，可提高酶的重复利用次数，实现酶的高效利用。

主权项：1.一种磁性纳米颗粒固定化磷脂酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1将FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O按摩尔比1:2溶于120mL蒸馏水中溶液A，称取0.8960gNaOH和6.8900gNaAc溶于80mL蒸馏水中溶液B，将超声粉碎机的超声探头置于溶液B中，向其缓慢滴加溶液A并同时开始超声化学反应80W，30min，得到Fe3O4磁性纳米颗粒；称取2gFe3O4超声分散于含160mL无水乙醇、40mL蒸馏水和5mL25％氨水的溶液中，30min后加入5mL正硅酸四乙酯，机械搅拌20h，得到Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒；将0.4g壳聚糖CS溶于100mL1.5％乙酸溶液中，再加入2gFe3O4@SiO2，在50℃水浴加热下搅拌均匀，45min后加入NaOH调节溶液pH至13.0，得到Fe3O4@SiO2@CS磁性纳米颗粒；在4％乙二胺四乙酸水溶液中，加入1.0gN-3-二甲基氨基丙基-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和0.8gN-羟基琥珀酰亚胺NHS，搅拌4h后，加入1gFe3O4@SiO2@CS，继续搅拌12h，得到Fe3O4@SiO2@CS-COOH磁性纳米颗粒；2称取Fe3O4@SiO2@CS-COOH磁性纳米颗粒50mg，加入2mLEDC溶液和5mLNHS溶液，在室温下活化0～120min；3磁性纳米颗粒活化完成后，加入40～120μLpH2.5～6.5的磷脂酶酶液磷脂酶LM、磷脂酶3G；4将磁性纳米颗粒与酶液混合物在20～40℃恒温水浴摇床中继续反应1～5h；5将悬浮液磁分离并吸出上清液，用磷酸盐缓冲液洗涤磁性固定化酶数次至无蛋白检出，洗涤液并入上清液中，将磁性固定化酶与上清液储存在4℃下备用。

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