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申请/专利权人：深圳源兴基因技术有限公司

摘要：本发明公开了一种腺病毒载体的高效培养方法，属于细胞与基因治疗技术领域，包括如下步骤：S1.细胞复苏和传代；S2.微载体及培养基准备；S3.微载体生物反应器细胞接种与培养；S4.微载体生物反应器病毒接种与扩增；S5.病毒收获；其中，所用微载体为磷脂‑RGD环肽偶联物改性微载体；所用培养基由基础培养基、细胞生长促进因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子和促病毒增殖因子组成。解决现有技术中由于腺病毒生产效率低而导致的大规模生产对高浓度、高纯度腺病毒载体的需求难以满足的问题。本发明具有腺病毒产量高，病毒的生产周期短的优势。

主权项：1.一种腺病毒载体的高效培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.细胞复苏和传代；S2.微载体及培养基准备；S3.微载体生物反应器细胞接种与培养；S4.微载体生物反应器病毒接种与扩增；S5.病毒收获；其中，所用微载体为磷脂-RGD环肽偶联物改性微载体；其中，S2中磷脂-RGD环肽偶联物改性微载体的制备步骤如下：（1）微载体预处理：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为微载体浸泡在重组人血清白蛋白溶液中，在37℃下孵育6-10h，然后洗涤备用；（2）磷脂偶联RGD环肽：将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺DSPE去盐酸化后在二氯甲烷中与3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯以1：1的摩尔比混合，反应48-96h后，加入二甲基甲酰胺、甲醇与超纯水的体积比为70：35：9的混合溶剂，再加入与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺DSPE摩尔数比例为1：2的RGD环肽，48-96h后进行固相萃取，然后透析，冷冻干燥，即得到磷脂-RGD环肽偶联物；（3）磷脂-RGD环肽偶联物改性微载体：将磷脂-RGD环肽偶联物以1：0.1-10的质量比溶解于缓冲液中，得到磷脂-RGD环肽偶联物溶液，再将预处理过的微载体与磷脂-RGD环肽偶联物溶液以1：0.1-10的质量比混合，在恒温振荡器上孵育，转速为100-120rpm，温度为22-24℃孵育16-24h，将孵育后的样本转移至离心管，以转速1000-3000rpm，离心5-20min后去除上清液，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3-5次，去除未结合的磷脂-RGD环肽偶联物和其他杂质后干燥备用；所述S2中培养基以DMEM培养基为基础培养基，添加细胞生长促进因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子和促病毒增殖因子；其中，细胞生长促进因子为人血清白蛋白、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、L-谷氨酰胺、N-乙酰半胱氨酸和β-羟基丁酸；转化生长因子为转化生长因子TGFβ和转化生长因子TGFα；胰岛素样生长因子为胰岛素样生长因子1；促病毒增殖因子为胰蛋白酶和N-乙酰半胱氨酸；所述细胞生长促进因子中人血清白蛋白浓度为4%、表皮生长因子浓度为50ngmL、成纤维细胞生长因子浓度为100ngmL、L-谷氨酰胺2mM、N-乙酰半胱氨酸1mM和β-羟基丁酸2mM；转化生长因子浓度为20ngmL；胰岛素样生长因子1浓度为50ngmL；促病毒增殖因子中胰蛋白酶浓度为0.1%，N-乙酰半胱氨酸摩尔浓度为1mM；其中，重组人血清白蛋白溶液由重组人血清白蛋白溶解于缓冲液中配制而成，所述缓冲液为0.05MpH9.5的N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液，所述重组人血清白蛋白溶液的摩尔浓度为10-50mM；所述S3中具体步骤如下：将100-300g磷脂-RGD环肽偶联物改性微载体装入生物反应器罐体里，生物反应器内加入S2中配制的培养基，将S1所得细胞接种到生物反应器上进行培养，初始密度为6×105-8×105个mL，pH值7.2-7.4自动调节，溶氧20-80%自动调节，细胞培养初始设定搅拌转速为60-90rpm，随着细胞生长和溶氧控制，逐渐加大搅拌转速至80-100rpm，批次换液培养6-7天，密度达到5×106-7×106个mL时开始灌注；所述S4中具体操作如下：S41.接种腺病毒到细胞罐中，MOI为0.05-0.4，静止吸附6h，然后加入2％的胎牛血清，搅拌转速40-60rpm，继续培养24h，加0.25％水解乳蛋白，溶氧30-50%自动调节，静止吸附6h后开启灌注，灌注量3-5VVD；S42.接毒后收获方式采用批式收获，收获时间点为接种腺病毒后的第48、72、96和120h，每24h补充葡萄糖2.5gL，维持葡萄糖浓度在2-3gL以上；所述S5中具体操作如下：第一次接种腺病毒后继续灌流培养至染毒48-120h，每日监测并记录葡萄糖浓度，待细胞每日葡萄糖消耗量为0.75-1.25gL时用低渗缓冲液破坏细胞膜，反复冲洗3-5次，收获细胞病毒裂解液并通过低速离心去除大颗粒物质，然后采用密度梯度离心纯化病毒颗粒，对收获的细胞病毒在4℃下用超滤浓缩管浓缩。

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