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申请/专利权人：扬州大学
摘要：本发明公开了一种犬回肠上皮永生化细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤：将犬回肠组织进行原代培养；设计并构建靶向犬回肠上皮细胞中hTERT基因的sgRNA表达载体、含有hTERT基因的修复模板；将sgRNA表达载体、Cas9表达载体、含有hTERT基因的修复模板共转染至犬回肠上皮细胞，在hTERT基因位点产生DSB，并引导细胞通过同源重组修复机制，将hTERT基因序列敲入到目标位点，得到携带hTERT基因的犬回肠上皮细胞；将携带hTERT基因的犬回肠上皮细胞进一步培养得到永生化的犬回肠上皮细胞系。本发明永生化的hTERT‑CIECs按照2×105个细胞25cm2，经过4天培养之后，细胞密度能够达到100％的汇合，增殖速度快；建立的永生化犬回肠上皮细胞系已传至50代，未出现任何衰老迹象，可永久保存。
主权项：1.一种犬回肠上皮永生化细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将犬回肠组织进行原代培养，得到犬回肠上皮细胞；S2、设计并构建靶向犬回肠上皮细胞中hTERT基因的sgRNA表达载体，以及含有hTERT基因的修复模板；S3、将sgRNA表达载体、Cas9表达载体以及含有hTERT基因的修复模板共转染至步骤S1得到的犬回肠上皮细胞，利用双镍酶策略在hTERT基因位点产生DSB，并引导细胞通过同源重组修复机制，将hTERT基因序列敲入到目标位点，得到携带hTERT基因的犬回肠上皮细胞；S4、将步骤S3得到的携带hTERT基因的犬回肠上皮细胞进一步培养得到永生化的犬回肠上皮细胞系。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 扬州大学 一种犬回肠上皮永生化细胞系的构建方法
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