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申请/专利权人：恺兴生命科技(上海)有限公司

摘要：本发明涉及特异性结合FAPα的结合单元，编码此类结合单元的多核苷酸，包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于生成该抗原结合单元的方法和使用本发明的FAPα特异性结合单元治疗疾病的方法。本发明的特异性结合FAPα的结合单元能够有效结合表达FAPα的肿瘤细胞，而包含所述结合单元的免疫效应细胞对表达FAP的肿瘤细胞表现出显著的杀伤能力。

主权项：1.一种靶向成纤维激活蛋白α的抗体，所述抗体包含轻链CDR区和重链CDR区，所述的重链CDR包含HCDR1，HCDR2，和HCDR3；所述的轻链CDR区包含LCDR1，LCDR2，和LCDR3；其中，所述的HCDR1是SEQIDNO:1所示的序列、所述的HCDR2是SEQIDNO:2所示的序列、所述的HCDR3是SEQIDNO:3所示的序列、所述的LCDR1是SEQIDNO:4所示的序列、所述的LCDR2是SEQIDNO:5所示的序列、所述的LCDR3是SEQIDNO:6所示的序列；或者所述的HCDR1是SEQIDNO:7所示的序列、所述的HCDR2是SEQIDNO:8所示的序列、所述的HCDR3是SEQIDNO:3所示的序列、所述的LCDR1是SEQIDNO:4所示的序列、所述的LCDR2是SEQIDNO:5所示的序列、所述的LCDR3是SEQIDNO:6所示的序列；或者所述的HCDR1是SEQIDNO:1所示的序列、所述的HCDR2是SEQIDNO:2所示的序列、所述的HCDR3是SEQIDNO:3所示的序列、所述的LCDR1是SEQIDNO:9所示的序列、所述的LCDR2是SEQIDNO:10所示的序列、所述的LCDR3是SEQIDNO:6所示的序列。

全文数据：靶向成纤维激活蛋白α的结合单元及其应用技术领域本发明涉及生物医药领域；具体地说，本发明涉及特异性结合FAPα的结合单元，编码此类结合单元的多核苷酸，包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于生成该抗原结合单元的方法和在疾病的治疗中使用它的方法。背景技术成纤维细胞激活蛋白αFibroblastactivationproteinα,FAPα是特异性表达于肿瘤相关成纤维细胞CAF表面的一种抗原分子NCBIReferenceSequence:NP_001278736.1，属于丝氨酸蛋白酶家族，具有胶原酶和二肽基肽酶活性，在肿瘤宿主界面基质的降解和重建中发挥着重要的作用，参与肿瘤的生长、浸润和转移，FAPα选择性表达于90％以上的恶性上皮肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、皮肤黑色素瘤、肾癌、膀胱癌等的基质，胚胎组织、愈合创面及生理性重建的器官中，而在正常成体组织中一般不表达。这些特点使FAPα成为多种肿瘤的成像、诊断以及治疗的抗原靶标。人FAPα最初是使用单克隆抗体mAbF19记载于WO9305804，ATCC编号HB8269在培养的成纤维细胞中鉴定的。基于F19抗体的人源化开发了西罗珠单抗SibrotuzumabBIBH1，一项利用西罗珠单抗进行的I期研究证明了131I标记的抗体的特异性肿瘤积累Scottetal.,ClinCancerRes9,1639-16472003。然而，未偶联的西罗珠单抗在具有转移性结肠直肠癌的患者中的一项早期II期试验因抗体缺少抑制肿瘤发展的功效而停止Hofheinzetal.,Inkologie26,44-482003。因此，本领域仍然需要增强的治疗方法，包括靶向FAPα、具有改良功效的抗体来治疗癌症。发明内容本发明目的在于发现特异性结合FAPα的结合单元，包括但不限于抗体以及开发靶向FAPα的免疫效应细胞。在第一方面，本发明提供一种抗原结合单元，所述抗原结合单元包含轻链CDR区和重链CDR区，所述的重链CDR包含HCDR1，HCDR2，和HCDR3；所述的轻链CDR区包含LCDR1，LCDR2，和LCDR3；其中，所述的HCDR1，HCDR2和HCDR3的序列独立选自下组：SEQIDNO:1-3、7和8，所述的LCDR1，LCDR2和LCDR3的序列独立选自下组：SEQIDNO:4-6、9和10。在具体的实施方式中，所述的HCDR1具有SEQIDNO:1或7所示的序列，所述的HCDR2具有SEQIDNO:2或8所示的序列，所述的HCDR3具有SEQIDNO:3所示的序列。在具体的实施方式中，所述的HCDR1，HCDR2和HCDR3的序列选自以下任一组：A.SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3；B.SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:3。在具体的实施方式中，所述的LCDR1具有SEQIDNO:4或9所示的序列，所述的LCDR2具有SEQIDNO:5或10所示的序列，所述的LCDR3具有SEQIDNO:6所示的序列。在具体的实施方式中，所述的LCDR1，LCDR2和LCDR3的序列选自以下任一组：A.SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6；B.SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:6。在具体的实施方式中，所述的HCDR1具有SEQIDNO:1或7所示的序列，所述的HCDR2具有SEQIDNO:2或8所示的序列，所述的HCDR3具有SEQIDNO:3所示的序列，所述的LCDR1具有SEQIDNO:4或9所示的序列，所述的LCDR2具有SEQIDNO:5或10所示的序列，所述的LCDR3具有SEQIDNO:6所示的序列。在具体的实施方式中，所述的HCDR1含有SEQIDNO:1所示的序列、所述的HCDR2含有SEQIDNO:2所示的序列、所述的HCDR3含有SEQIDNO:3所示的序列、所述的LCDR1含有SEQIDNO:4所示的序列、所述的LCDR2含有SEQIDNO:5所示的序列、所述的LCDR3含有SEQIDNO:6所示的序列；或者所述的HCDR1含有SEQIDNO:7所示的序列、所述的HCDR2含有SEQIDNO:8所示的序列、所述的HCDR3含有SEQIDNO:3所示的序列、所述的LCDR1含有SEQIDNO:4所示的序列、所述的LCDR2含有SEQIDNO:5所示的序列、所述的LCDR3含有SEQIDNO:6所示的序列；或者所述的HCDR1含有SEQIDNO:1所示的序列、所述的HCDR2含有SEQIDNO:2所示的序列、所述的HCDR3含有SEQIDNO:3所示的序列、所述的LCDR1含有SEQIDNO:9所示的序列、所述的LCDR2含有SEQIDNO:10所示的序列、所述的LCDR3含有SEQIDNO:6所示的序列。在具体的实施方式中，所述的抗原结合单元具有SEQIDNO:11或15所示的重链可变区，和SEQIDNO:13或17所示的轻链可变区。在优选的实施方式中，所述抗原结合单元是抗体，优选单克隆抗体或其活性片段。在第二方面，本发明提供第一方面所述的抗原结合单元的突变体，所述突变体与第一方面所述的抗原结合单元竞争结合FAPα。在具体的实施方式中，所述突变体与第一方面所述的抗原结合单元在轻链可变区序列上有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；或者，所述突变体与权利要求1-8任一所述的抗原结合单元在在重链可变区序列上有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；优选地，所述突变体与第一方面所述的抗原结合单元在轻链CDR区，例如轻链CDR1或CDR2的序列上有70％以上；优选地，75％以上；更优选地，80％以上的相同性；或者，所述突变体与第一方面所述的抗原结合单元在重链CDR区，例如重链CDR1或CDR2的序列上有60％以上；优选地，70％以上；更优选地，80％以上的相同性。在具体的实施方式中，所述突变体与第一方面所述的抗原结合单元竞争结合FAPα上同一结合表位。在第三方面，本发明提供一种抗原结合单元，所述抗原结合单元包含轻链CDR区和重链CDR区，所述的重链CDR包含HCDR1，HCDR2和HCDR3；所述的轻链CDR区包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中，所述的HCDR1，HCDR2和HCDR3独立选自与SEQIDNO:1-3、7、8中任一序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列，所述的LCDR1，LCDR2和LCDR3独立选自与SEQIDNO:4-6、9、10中任一序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列。在具体的实施方式中，所述的HCDR1具有SEQIDNO:1或7所示的序列，所述的HCDR2具有SEQIDNO:2或8所示的序列，所述的HCDR3具有SEQIDNO:3所示的序列。在具体的实施方式中，所述的HCDR1，HCDR2和HCDR3的序列选自以下任一组：A.SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3；B.SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:3。在具体的实施方式中，所述的LCDR1具有SEQIDNO:4或9所示的序列，所述的LCDR2具有SEQIDNO:5或10所示的序列，所述的LCDR3具有SEQIDNO:6所示的序列。在具体的实施方式中，所述的LCDR1，LCDR2和LCDR3的序列选自以下任一组：A.SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6；B.SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:6。在具体的实施方式中，所述的HCDR1具有SEQIDNO:1或7所示的序列，所述的HCDR2具有SEQIDNO:2或8所示的序列，所述的HCDR3具有SEQIDNO:3所示的序列，所述的LCDR1具有SEQIDNO:4或9所示的序列，所述的LCDR2具有SEQIDNO:5或10所示的序列，所述的LCDR3具有SEQIDNO:6所示的序列。在具体的实施方式中，所述的HCDR1含有SEQIDNO:1所示的序列、所述的HCDR2含有SEQIDNO:2所示的序列、所述的HCDR3含有SEQIDNO:3所示的序列、所述的LCDR1含有SEQIDNO:4所示的序列、所述的LCDR2含有SEQIDNO:5所示的序列、所述的LCDR3含有SEQIDNO:6所示的序列；或者所述的HCDR1含有SEQIDNO:7所示的序列、所述的HCDR2含有SEQIDNO:8所示的序列、所述的HCDR3含有SEQIDNO:3所示的序列、所述的LCDR1含有SEQIDNO:4所示的序列、所述的LCDR2含有SEQIDNO:5所示的序列、所述的LCDR3含有SEQIDNO:6所示的序列；或者所述的HCDR1含有SEQIDNO:1所示的序列、所述的HCDR2含有SEQIDNO:2所示的序列、所述的HCDR3含有SEQIDNO:3所示的序列、所述的LCDR1含有SEQIDNO:9所示的序列、所述的LCDR2含有SEQIDNO:10所示的序列、所述的LCDR3含有SEQIDNO:6所示的序列。在第四方面，本发明提供一种抗原结合单元，所述的抗原结合单元具有与SEQIDNO:11或15所示的重链可变区的序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列，和与SEQIDNO:13或17所示的轻链可变区具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列。在第五方面，本发明提供第一到第四方面所述的抗原结合单元或抗原结合单元突变体，所述的抗原结合单元是单克隆抗体、全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体。在具体的实施方式中，所述的抗原结合单元是scFv、Fv、Fab、Fab2或者单域抗体。在第六方面，本发明提供编码第一到第五方面所述的抗原结合单元的核酸。在第七方面，本发明提供一种表达载体，其包含第六方面所述的核酸。在第八方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含第七方面所述的表达载体或基因组中整合有第六方面所述的核酸。在第九方面，本发明提供一种双价蛋白，由第五方面所述的scFv序列与一个或多个重链恒定区域融合所形成具有人免疫球蛋白Fc区的抗体；优选地，所述的人免疫球蛋白Fc区连接有缀合物；优选的，所述缀合物优选自荧光染料、细胞毒素、放射性同位素。在第十方面，本发明提供一种多功能免疫辍合物，所述的多功能免疫辍合物包括:第一到第五方面所述的抗原结合单元，以及与之连接的功能性分子；其中，所述的功能性分子选自:a靶向肿瘤表面标志物的分子，包括结合免疫细胞表面标志物的抗体或配体；较佳地，所述的免疫细胞表面标志物包括:CD3，CD16，CD28；更佳地，所述的结合免疫细胞表面标志物的抗体是抗CD3抗体；最佳地，所述的靶向免疫细胞的表面标志物的分子是结合T细胞表面标志物的抗体；b抑制肿瘤的分子,包括抗肿瘤的细胞因子或抗肿瘤的毒素，较佳的，所述的细胞因子包括:IL-12、IL-15、I型干扰素、TNF-alpha；c靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物。在第十一方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的胞外域包含第一到第五方面所述的抗原结合单元，该抗原结合单元优选单链抗体或单域抗体。在优选的实施方式中，所述嵌合抗原受体还包含跨膜域及胞内信号域，所述的跨膜域，较佳地，选自TCR的α、β、zeta链，CD3ε，CD3ζ，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD152，CD154，和PD1的跨膜区；更佳地，选自CD8α，CD4，CD45，PD1，CD154和CD28的跨膜域；和或所述胞内信号域包含一个或多个共刺激信号域和或初级信号域；其中，所述的共刺激信号域，较佳地，选自CARD11，CD2，CD7，CD27，CD28，CD30，CD40，CD54，CD83，OX40，CD137，CD134，CD150，CD152，CD223，CD270，PD-L2，PD-L1，CD278，DAP10，LAT，NKD2CSLP76，TRIM，FcεRIγ，MyD88，和41BBL的胞内信号区；和或所述初级信号域选自TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b，CD278也称作“ICOS”和CD66d，和CD3ζ；更佳地，选自CD137，CD134，CD28和OX40；和或所述初级信号域选自CD3ζ。在优选的实施方式中，所述的跨膜域选自CD8α或CD28，所述共刺激信号域选自CD137或CD28的胞内信号域，所述初级信号域选自CD3ζ。在具体的实施方式中，所述的嵌合抗原受体包括如下顺序连接的抗体，跨膜区和胞内信号区：第一到第五方面所述的抗原结合单元、CD8和CD3ζ；第一到第五方面所述的抗原结合单元、CD8、CD137和CD3ζ；第一到第五方面所述的抗原结合单元、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区和CD3ζ；或第一到第五方面所述的抗原结合单元、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区、CD137和CD3ζ。在第十二方面，本发明提供编码第十一方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。在第十三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含第十二方面所述的核苷酸序列。在第十四方面，本发明提供一种病毒，所述的病毒包含第十三方面所述的表达载体。在第十五方面，本发明提供一种基因修饰的免疫细胞，其转导有第十二方面所述的核苷酸序列、或第十三方面所述的表达载体、或第十四方面所述的病毒；或者，其表达第十一方面所述的嵌合抗原受体。在优选的实施方式中，所述的免疫细胞包括但不限于以下细胞及其组合：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞。在具体的实施方式中，所述基因修饰的免疫细胞还表达有除嵌合抗原受体之外的其他序列，所述其他序列包括细胞因子、另一种嵌合抗原受体、趋化因子受体、降低PD-1表达的siRNA或者阻断PD-L1的蛋白、TCR、或安全开关；较佳地，所述的细胞因子包括IL-12、IL-15、IL-21、或I型干扰素；较佳地，所述趋化因子受体包括CCR2、CCR5、CXCR2、或CXCR4；较佳地，所述安全开关包括iCaspase-9、TruancatedEGFR或RQR8。在第十六方面，本发明提供第一到第五方面所述的抗原结合单元、或第九方面所述的双价蛋白、或第十方面所述的免疫辍合物、或第十一方面所述的嵌合抗原受体、或第十二方面所述的核苷酸序列、或第十三方面所述的表达载体、或第十四方面所述的病毒、或第十五方面所述的免疫细胞的用途，用于制备治疗、预防或诊断高表达FAPα相关的疾病的药物或试剂。在具体的实施方式中，所述的高表达FAPα相关的疾病是肿瘤。在具体的实施方式中，所述的肿瘤是乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、皮肤黑色素瘤、肾癌、膀胱癌。在第十七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第一到第五方面所述的抗原结合单元或编码该抗原结合单元的核酸；或第九方面所述的双价蛋白；或第十方面所述的免疫辍合物或编码该辍合物的核酸；或第十一方面所述的嵌合抗原受体或编码该嵌合抗原受体的核酸；或第十五方面所述的基因修饰的免疫细胞。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文如实施例中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了SDSPAGE分析镍柱纯化重组humanFAPα_HishuFAP,mouseFAP_HismFAP的结果；图2显示了ELISA测定噬菌体克隆表达上清液和重组huFAPa，mFAP的结合；图3显示了FACs检测部分纯化的克隆和U-87MG以及A549细胞的结合；图4显示了Biacore测定1A7、8E3scFv结合huFAP，mFAP的亲和力；图5显示了抗体1A7、8E3与亲本抗体10A4的序列比对scFv；图6为SDSPAGE分析纯化的抗体1A7、8E3scFv_Fc；图7为Westernblot检测3T3-mFAP，HT1080-huFAPα稳转细胞系的结果；图8为FACs检测3T3-mFAPa，HT1080-huFAPαb稳转细胞系的结果；图9显示了FACs测定抗体10A4、1A7、8E3scFv_Fc与U-87MG、3T3-mFAP、HT1080-huFAPα细胞的结合；图10是利用Anti-Flag抗体FACs检测3T3-mFAPa、HT1080-huFAPb稳转细胞系中mFAPα及huFAPα的表达；图11是FACs检测hu8E3-28ZCAR在T细胞中的表达；图12是细胞毒性检测表达hu8E3-28ZCAR的T细胞对3T3-mFAPa及H1080-huFAPαb细胞的杀伤。具体实施方式发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现特异性结合FAP的抗体，在此基础上开发了特异性靶向FAP的免疫效应细胞。本发明的抗体能够有效结合表达FAP的肿瘤细胞，本发明的免疫效应细胞对表达FAP的肿瘤细胞表现出显著的杀伤能力，从而能够有效而安全地应用于多发性骨髓瘤等恶性肿瘤的治疗。在此基础上完成了本发明。以下具体说明详尽地展示了本文所公开的实施方案。应当理解，本说明书并非意欲仅限于此处所公开的具体的实施方案，而是可以发生改变。本领域技术人员将理解，本说明书中所公开的内容可以有多种改变或变化，而均涵盖于所公开的范围和原则之内。除非另有说明，每个实施方案均可与任何其他实施方案任意组合。本文所公开的某些实施方案包含了数值范围，并且本发明的某些方面可采用范围的方式描述。除非另有说明，应当理解数值范围或者以范围描述的方式仅是出于简洁、便利的目的，并不应当认为是对本发明的范围的严格限定。因此，采用范围方式的描述应当被认为具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的所有可能的具体数值点，正如这些子范围和数值点在本文中已经明确写出。当涉及可测量值比如量、暂时持续时间等时，术语“约”是指包括指定值的±20％、或在某些情况下±10％、或在某些情况下±5％、或在某些情况下±1％、或在某些情况下±0.1％的变化。术语定义本文所用的术语具有与本领域技术人员常规理解相似的含义。为清晰起见，现对其中一些术语定义如下。本文所用的术语“FAPα”是指成纤维细胞激活蛋白α。人成纤维细胞激活蛋白α由760个氨基酸残基组成的跨膜蛋白NCBIReferenceSequence:NP_001278736.1。如果没有特别说明，本文中的FAPα是指人成纤维细胞激活蛋白α。鼠的成纤维细胞激活蛋白由761个氨基酸残基组成由760个氨基酸残基组成的跨膜蛋白，NCBIReferenceSequence:NP_032012.1。本文所用的术语“结合单元”、“抗原结合单元”或“抗原结合蛋白”具有相同的含义，在本文可以互换使用，是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的任何形式的免疫活性部分；即，包含特异性结合抗原或与抗原免疫反应的抗原结合位点的分子。结构上，最简单的天然产生的抗体例如，IgG具有四个多肽链，通过二硫键相互连接的两个重H链和两个轻L链。免疫球蛋白代表了包括几种分子类型在内的一大族分子，例如IgD、IgG、IgA、IgM和IgE。抗原结合单元包括但不限于Fv、scFv、dFv、dAb、二链抗体、三链抗体、四链抗体、结构域Ab、Fab片段、Fab’、Fab’2、双特异性抗体和多特异性的抗体。本文所用的术语“竞争结合”是指两种或多种物质与结合对象的同一位置，例如，某抗原的同一结合表位相结合；换言之，结合在同一结合对象上的不同位置的不同物质不存在本文所述的“竞争结合”的关系。本文所用的术语“抗原结合单元”还包括多物种来源的免疫球蛋白分子，包括无脊椎动物和脊椎动物。应用于抗原结合单元的术语“人”是指由人类基因或其片段表达的免疫球蛋白分子。应用于非人例如啮齿动物或灵长类动物抗体的术语“人源化”是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的杂交免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段。对于其大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白受者抗体recipientantibody，其中来自受者互补决定区CDR的残基被来自具有所需特异性、亲和力和容量的非人物种如小鼠、大鼠、兔或灵长动物的CDR供者抗体的残基取代。在某些情况中，非人免疫球蛋白的Fv框架区FR残基被相应的人残基取代。另外，人源化抗体可以包含既不在受者抗体也不在输入的CDR或框架序列中发现的残基。进行这些修饰以进一步完善和优化抗体性能和在引入人体时最大程度降低免疫原性。一般而言，人源化抗体包含基本上全部的至少一个和通常两个可变域，其中全部或基本上全部CDR区域对应于非人免疫球蛋白的CDR区域且全部或基本上全部FR区域为非人免疫球蛋白序列的FR区域。本文所用的术语“抗体”，作为本领域已知的那些术语，指免疫系统的抗原结合蛋白。如本文提到的术语“抗体”包括具有抗原结合区域的完整的全长抗体及其中“抗原结合部分”或“抗原结合区域”保留的其任何片段、或其单链例如单链可变片段scFv。天然抗体指包含通过二硫键互联的至少两条重H链和两条轻L链或其抗原结合片段的糖蛋白。术语“抗体”还包括抗体特别是本文所述抗体的所有重组形式，例如在原核细胞中表达的抗体，未糖基化的抗体以及与抗原结合的抗体片段和下文所诉的衍生物。每条重链由重链可变区本文缩写为VH和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区本文缩写为VL和轻链恒定区组成。VH和VL可进一步细分为称为互补性决定区CDR的高变区，它们散布在称为构架区FR的更保守区域中。每条VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞如效应细胞和经典补体系统的第一成分C1q。本文所用的术语“Fab”或“Fab区”包括包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指分离的该区域，或者位于全长抗体或抗体片段环境中的该区域。本文中的术语“Fc”或“Fc区”包括包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域以外的抗体恒定区的多肽。因而，Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，和IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，和这些结构域N端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc包括免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3和在Cγ1和Cγ2之间的铰链。虽然Fc区的边界可以改变，但人IgG重链Fc区通常定义为在其羧基端包含残基C226或P230，其中编号是根据Kabat的EU索引。对于人IgG1，Fc在本文定义为包含残基P232至其羧基端，其中编号是根据Kabat中的EU索引。Fc可以指分离的该区域，或者位于Fc多肽，例如抗体，环境中的该区域。本文中使用的术语“亲本抗体”或“亲本免疫球蛋白”包括未修饰的抗体，所述抗体之后经修饰产生变体。所述亲本抗体可以使天然存在的抗体，或者天然存在的抗体的变体或改造版本。亲本抗体可以指抗体本身，包含所述亲本抗体的组合物，或其编码氨基酸序列。本文中使用的术语“亲本抗体”或“亲本免疫球蛋白”包括之后经修饰产生人源化抗体的鼠抗体或嵌合抗体。本文中使用的术语“变体抗体”或“抗体变体”或“变体”包括由于相比亲本的至少一个氨基酸修饰，而不同于亲本抗体序列的抗体序列。抗体变体可以指抗体本身，也可以指包含所述亲本抗体的组合物。在具体的实施方式指，本文所述的变体抗体的轻链可变区序列与亲本抗体的轻链可变区序列有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；本文所述的变体抗体的重链可变区序列与亲本抗体的重链可变区序列有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在优选的实施方式中，本文所述的变体抗体的轻链CDR区，例如轻链CDR1或CDR2的序列与亲本抗体的轻链CDR区，例如轻链CDR1或CDR2序列有70％以上的相同性；优选地，75％以上的相同性；更优选地，80％以上的相同性；本文所述的变体抗体的重链CDR区，例如重链CDR1或CDR2的序列与亲本抗体的重链CDR区，例如重链CDR1或CDR2序列有60％以上的相同性；优选地，70％以上的相同性；更优选地，80％以上的相同性。术语“氨基酸修饰”包括氨基酸取代、添加和或缺失，“氨基酸取代”意指用另一种氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。例如，取代R94K指94位的精氨酸被赖氨酸替换，本文中使用的“氨基酸插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置添加氨基酸。文中使用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。本文中使用的术语“保守修饰”或“保守序列修饰”意指不显著影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、插入和缺失。可通过本领域已知的标准技术将修饰导入本发明的抗体中，例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守的氨基酸取代是用具有相似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括含碱性侧链的氨基酸例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸、酸性侧链例如，天冬氨酸、谷氨酸、不带电的极性侧链例如，甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、非极性侧链例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、β分支侧链例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和芳香族侧链例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸。因而，可以用其他相同侧链家族的氨基酸残基替换本发明抗体的CDR区中或框架区中的一个或多个氨基酸残基，并可以测试所改变的抗体变体抗体保留的功能。抗体片段包括但不限于：i由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段，包括Fab’和Fab’-SH，iiVH和CH1结构域组成的Fd片段，iii由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；iv由单个可变区组成的dAb片段Ward等，1989，Nature341：544-546；vFab’2片段，包含2个连接的Fab片段的二价片段；vi单链Fv分子抗原结合位点Bird等，1988，Science242：423-426；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A85:5879-5883；vii双特异性单链Fv二聚体PCTUS9209965；viii“二体”或“三体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段Tomlinson等，2000，MethodsEnzymol.326:461-479；WO9413804；Holliger等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A90:6444-6448；和ix与相同或不同抗体遗传融合的scFvColoma&Morrison,1997,NatureBiotechnology15,159-163。根据恒定区基因测定，将抗体分类，也称为同种型。人的恒定轻链分为КCК和λCλ轻链。重链分为μ、δ、γ、α或ε，并分别定义抗体的同种型IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG类是最常用于治疗目的的。在人中，该类别包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，该类别包括亚类IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA具有若干亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。因而，本文中使用的“同种型”意指通过恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白的任何类或亚类。已知的人免疫球蛋白同种型是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE。抗FAPα的抗体在本公开中，描述了具有基于scFv的抗原结合区域的抗原结合蛋白，包括抗体。其中使用重组FAPα，从人scFv噬菌体展示文库选择scFv。在一些实施方案中，本发明包括具有scFv序列的抗体，所述scFv序列与一个或多个重链恒定区域融合以形成具有人免疫球蛋白Fc区的抗体以产生双价蛋白，从而增加抗体的总体亲和力和稳定性。此外，Fc部分允许将其他分子包括但不限于荧光染料、细胞毒素、放射性同位素等与例如用于抗原定量研究中的抗体直接缀合，以便固定抗体用于亲和力测量、用于定向递送治疗药、使用免疫效应细胞测试Fc介导的细胞毒性和许多其它应用。本文提供的结果突出表现出本发明抗体在靶向FAPα时的特异性、灵敏性和效用。本发明的分子基于使用噬菌体展示鉴定和选择单链可变片段scFv，所述单链可变片段的氨基酸序列赋予分子针对FAPα的特异性并且形成本发明的全部抗原结合蛋白的基础。因此，所述scFv可以用来设计一系列不同“抗体”分子，包括例如全长抗体、其片段如Fab和Fab’2、融合蛋白包括scFv_Fc、多价抗体、即，具有针对相同抗原或不同抗原的多于一种特异性的抗体，例如，双特异性T细胞结合抗体BiTE、三抗体等见Cuesta等，Multivalentantibodies:whendesignsurpassesevolution,TrendsinBiotechnology28:355-362,2010。在抗原结合蛋白是全长抗体的一个实施方案中，本发明抗体的重链和轻链可以是全长例如，抗体可以包括至少一条并优选地两条完整重链，和至少一条并优选地两条完整轻链或可以包括抗原结合部分Fab、Fab’2、Fv或scFv。在其他实施方案中，抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE。抗体类型的选择将取决于所设计的抗体欲引发的免疫效应子功能。在构建重组免疫球蛋白时，各种免疫球蛋白同种型的恒定区的适宜氨基酸序列和用于产生广泛种类抗体的方法是本领域技术人员已知的。在另一方面，本发明提供了结合FAPα的抗原结合单元，其包括选自SEQIDNO:11、15的重链可变区序列。在另一方面，本发明提供了结合FAPα的抗原结合单元，其包括选自SEQIDNO:13、17的轻链可变区序列。考虑到这些重链和轻链可变区序列各自可以结合FAPα，可以“混合和匹配”重链和轻链可变区序列来产生本发明的抗FAPα的结合分子。在另一个方面，本发明提供了结合FAPα的抗体或其片段的变体。因而本发明提供了抗体或其片段，具有与本发明抗体的重链或轻链的可变区序列至少80％相同的重链和或轻链可变区。优选的，重链和或轻链可变区的氨基酸序列同一性是至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％，特别是96％，更特别97％，甚至更特别98％，最特别99％，包括例如80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％。抗FAPα的抗体特性评估抗体，例如抗FAP的抗体的结合能力的标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、Biacore、Western印迹和流式细胞仪分析。合适的测定详细描述在实施例中。核酸、载体和宿主细胞本发明还提供了编码结合FAPα的抗体和其片段分离的核酸、载体以及包含所述核酸或载体的宿主细胞。核酸可位于完整细胞中、细胞裂解液中或者以部分纯化的或基本纯化的形式。可以使用标准的分子生物学技术获得本发明的核酸，例如可以通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术，获得编码抗体的轻链和重链或者编码VH和VL区段的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体例如，使用噬菌体展示技术，可以从文库回收编码抗体的一种或多种核酸。向宿主细胞中导入外源核酸的方法是本领域普遍已知的，并可随所使用的宿主细胞而变化。为了表达蛋白质，可以将编码本发明抗体的核酸整合到表达载体中。多种表达载体可用于蛋白质表达。表达载体可包括自我复制的染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。用于本发明的表达载体包括但不限于使蛋白质能够在哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母和体外系统中表达的那些。如本领域已知的，多种表达载体是可商业或其他方式获得的。可用于本发明中来表达抗体。本发明的优点：1.本发明提供了特异性结合FAPα的抗体；2.本发明提供了特异性靶向FAPα的免疫效应细胞；和3.本发明的抗体能够有效结合表达FAPα的肿瘤细胞，本发明的免疫效应细胞对表达FAP的肿瘤细胞表现出显著的杀伤能力。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1.FAPα重组蛋白的制备体外合成人FAPα的胞外段Leu26-Asp760基因，在该基因C端插入His标签，中间以“GS”相连接，形成融合表达蛋白humanFAPα_HisSEQIDNO:19，相对应的基因序列如SEQIDNO:20所示。体外合成鼠的FAP胞外段基因Leu26-Asp761C端插入His标签，中间以“GS”相连接，形成融合表达蛋白mouseFAPα_HisSEQIDNO:21，相对应的基因序列如SEQIDNO:22所示。采用293F细胞分别瞬时转染表达humanFAPα_His和mouseFAPα_His，转染的方法参照293F细胞的使用说明书。转染后采用镍柱亲和纯化。纯化后SDS-PAGE电泳，结果如图1所示，E2中都得到了纯度较高的目的蛋白。用0.22um的膜过滤后，使用截流量为10KD的millipore超滤管进行浓缩，浓缩至体积1ml以内，使用PD-Midi脱盐柱脱盐，收集得到人和鼠的FAPα重组蛋白。实施例2.使用全人噬菌体展示文库筛选针对FAP特异的scFv本发明使用的噬菌体展示文库为本申请人构建的全人的天然的scFv噬菌体文库，库容为1E+11。利用本领域技术人员已知的筛选方法，包被10ugml抗原humanFAPα于免疫管，将噬菌体文库加入包被了humanFAPα的免疫管中结合1.5小时，筛选和富集与FAPα特异性结合的scFv噬菌体克隆。通过针对FAPα的标准ELISA方法确定阳性克隆，共筛选了1344个克隆，挑取其中ELISA结合信号最高的96个克隆图2，经测序，得到16个单一的序列，表达纯化这16个克隆并通过Biacore测定亲和力。结果如表1所示：表1FACs检测和内源性表达FAPα的U-87MG细胞购自中国科学院细胞库结合，不表达FAPα的A549细胞购自中国科学院细胞库做为阴性对照细胞。使用GuavaeasyCyteTMHTSystem仪器检测，结果如图3所示，抗体10A4特异性的结合U-87MG细胞。经测序分析，10A4的重链可变区为SEQIDNO:11所示的序列，重链的HCDR1、HCDR2、HCDR3的序列分别如SEQIDNO:1、2、3所示。10A4的轻链可变区为SEQIDNO:13所示的序列，轻链的LCDR1、LCDR2、LCDR3的序列分别如SEQIDNO:4、5、6所示。实施例4.抗体10A4的亲和力成熟文库的构建以及亲和力成熟文库的筛选基于抗体10A4的亲和力成熟文库的构建保留了轻链以及重链的CDR3区域，通过简并引物，分别随机化轻链的CDR1和CDR2或者重链的CDR1和CDR2构建了两个亲和力成熟文库。具体构建方法简述如下：首先基于抗体10A4的scFv氨基酸序列SEQIDNO:23，核苷酸序列SEQIDNO:24构建模板质粒。对于轻链CDR1和CDR2随机化的噬菌体文库，使用引物LMFSEQIDNO:41和F10L1RSEQIDNO:45PCR扩增片段1；使用引物F10L2FSEQIDNO:46和FdRSEQIDNO:44PCR扩增片段2；通过搭桥PCR连接片段1和片段2得到含有随机化序列的scFv全长，然后用NcoI和NotI酶切全长片段，通过T4连接酶连接入同样酶切的模板质粒中。并电转化至TG1感受态细胞中，库容为1.5E+9。对于重链CDR1和CDR2随机化的噬菌体文库，使用引物LMFSEQIDNO:41和F10H1RSEQIDNO:42，PCR扩增片段3；使用引物F10H2FSEQIDNO:43和FdRSEQIDNO:44，PCR扩增片段4；然后通过搭桥PCR连接片段3和片段4得到含有随机化序列的scFv全长，然后用NcoI和NotI酶切全长片段，通过T4连接酶连接入同样酶切的模板质粒中。并电转化至TG1感受态细胞中，库容为6.6E+8。亲和力成熟文库的筛选与实施例2中的描述基本一致。包被5ugml或者1ugml抗原humanFAPα于免疫管，将噬菌体文库加入包被了humanFAPα的免疫管中结合1.5小时，经筛选和富集，得到与humanFAPα特异性结合的scFv噬菌体克隆。通过标准ELISA方法确定阳性克隆，挑取ELISA信号高的克隆表达纯化，经Biacore测定见图4，得到2个克隆1A7、8E3表现比亲本抗体10A4要好，亲本抗体10A4对人FAPα的亲和力为197nM，如图4所示，抗体1A7对人FAPα的亲和力为13.5nM，相比10A4提高了14倍，抗体8E3对人FAPα的亲和力为81.6nM，相比10A4提高了2.4倍。两个抗体都与鼠FAP结合，亲和力分别为112nM和267nM。对1A7、8E3进行测序，测序的结果显示，与亲本抗体10A4相比，抗体1A7一共有7处点突变，其中2处位于重链的CDR1，第31位由Ser变成Pro，第33位由Ala变成Thr；有5处位于重链的CDR2，第52位由Ile变成Val，第54位有Ile变成Asn，第55位由Phe变成Val，第57位由Thr变成Val，第59位由Asn变成Thr。抗体8E3一共有6处点突变，其中4处位于轻链的CDR1，第32位由Ser变成Pro，第35位由Tyr变成Phe，第37位由Tyr变成His，第39位由Asp变成Tyr；有两处位于轻链的CDR2，第55位由Leu变成Val，第57位由Ser变成Gly。序列比对的结果见图5所示，抗体同一性的比较发现：1A7和10A4相比，重链的CDR1的序列具有60％的相似性，重链的CDR2具有70.5％的相似性，重链的CDR3具有100％的相似性，重链可变区具有93.9％的相似性共116个氨基酸，7个不同。8E3和10A4相比，轻链的CDR1的序列具有75％的相似性共16个氨基酸，4个不同，轻链的CDR2具有71.4％的相似性共7个氨基酸，2个不同，轻链的CDR3具有100％的相似性，轻链可变区具有94.6％的相似性共113个氨基酸，6个不同。实施例5.scFv_Fc融合抗体的构建及其在真核细胞中的瞬转表达纯化分别针对10A4、1A7、8E3的VH和VL片断设计引物，引入由15个柔性氨基酸GGGGSGGGGSGGGGS组成的linker连接组成scFv10A4，SEQIDNO:23；1A7，SEQIDNO:25；8E3，SEQIDNO:27；在VH上游引入NheI的酶切位点和保护碱基，在VL的下游引入BamHI的酶切位点和保护碱基。1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并纯化回收。酶切后连接入含有人IgG1重链恒定区的Fc段Asp104-Lys330的V152购自上海锐劲生物技术有限公司真核表达载体中。采用293fectinTMTransfectionreagentInvitrogen,12347-019或者聚乙烯亚胺PEISigma-Aldrich,408727瞬时转染对数生长期的293F细胞。转染5-7天后收集培养上清通过ProteinA进行亲和纯化。SDSPAGE分析纯化产物，如图6所示，还原条件下，条带大小为50kD，符合预期。实施例6.HT1080-huFAPα,3T3-mFAP稳转细胞系的构建1.慢病毒包装质粒pWPT-huFAPα_Flag，pWPT-mFAP_Flag的构建体外合成huFAPa的全长序列，并在C端插入Flag标签SEQIDNO:29，并通过MluISalI双酶切，插入同样双酶切的慢病毒包装质粒pWPT中。体外合成mFAPa的全长序列，并在C端插入Flag标签SEQIDNO:30，并通过MluISalI双酶切，插入同样双酶切的慢病毒包装质粒pWPT中。2.mFAP病毒液和huFAPα病毒液的制备接种6×106细胞至培养皿中，当细胞汇合度为70％-80％时进行转染，转染前1h把293T的培养基更换为完全培养基。在EP管中加入800ulDMEM，随后加入5ugpWPT-mFAP-Flag质粒，7.5ugpsPAX.2质粒，2.5ugpMD2.G质粒涡旋振荡8s混匀；然后在另一个EP管中，加入800ulDMEM和45uL1ugulPEI室温下静置5分钟。将质粒混合液逐滴加入PEI孵育液中，混匀室温静置20分钟。然后将配置的质粒PEI混合液逐滴加入细胞中。转染6小时候，将培养基更换为新鲜的完全培养基。转染72小时候，收集细胞培养上清，4度，3000rpm离心15分钟，取上清用0.45um滤膜过滤，得到mFAP病毒液。huFAP病毒液的制备方法同mFAP病毒液的制备。3.病毒感染细胞第一天，接种1×1053T3细胞于6cm培养皿。第二天，弃上清并加入1ml新鲜的完全培养基，然后加入4mlmFAP病毒液液和终浓度为6ugml的polybrene培养，得到3T3-huFAP混合克隆细胞。采用huFAPα病毒感染HT1080细胞，方法同mFAP病毒液感染3T3细胞。4.3T3-mFAP、HT1080-huFAPα混合克隆Westernblot鉴定3T3-huFAP混合克隆细胞或者HT1080-huFAPα混合克隆细胞以蛋白裂解液裂解，离心后取上清进行BCA测定浓度，以3T3作为阴性对照，一抗：anti-FLAG-HRPM2，1:400稀释用。结果如图7所示。5.流式检测分别将HT1080-huFAPα和3T3-mFAP的混合克隆细胞消化后计数，以有限稀释法进行单克隆铺板，得到HT1080-huFAPα和3T3-mFAP的稳转细胞系。分别取4×105cells进行流式检测，使用GuavaeasyCyteTMHTSystem仪器检测。结果如图8所示，两株稳转细胞系中都能检测到FAP的表达。采用Anti-Flag抗体流式检测3T3-mFAP，HT1080-huFAPα细胞系，取1×106个细胞进行流式检测，结果如图10所示，通过检测FAP上携带的Flag标签，在两株稳转细胞系中都能检测到FAP的表达。实施例7.FACs测定抗体10A4、1A7、8E3的scFv_Fc与U-87MG、3T3-mFAP、HT1080-huFAPα细胞的结合以3T3细胞和HT1080细胞做为阴性对照细胞。具体步骤为：收获细胞，用生长培养基洗涤细胞一次，重悬于PBS中，调整细胞浓度为4E+5细胞ml。在冰上将200nM抗体与细胞育30分钟。其后与FITC标记的抗人IgG第二抗体孵育。两次洗涤之后，使用GuavaeasyCyteTMHTSystem仪器检测。结果如图9所示，抗体10A4能结合稳定转染的huFAPα的HT1080细胞系，稳定转染mFAP的3T3细胞系以及内源性表达huFAPα的U-87MG细胞，但是不结合不表达huFAPα的HT1080细胞系，非特异性的结合3T3细胞系。抗体8E3和阴性细胞系3T3、HT1080都不结合，但是和FAP表达阳性的细胞系HT1080-huFAPα、3T3-mFAP、U-87MG都结合。抗体1A7和阴性细胞系3T3、HT1080都不结合，和HT1080-huFAPα、3T3-mFAP都结合，但是不结合U-87MG细胞。实施例8.靶向FAPα的嵌合型抗原受体CAR修饰的T细胞的制备1.慢病毒包装质粒pRRL-hu8E3-28Z的构建以PRRLSIN-cPPT.EF-1α为载体，构建了表达抗体10A4、1A7、8E3的二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒，包括PRRLSIN-cPPT.EF-1α-10A4-28Z、PRRLSIN-cPPT.EF-1α-1A7-28Z以及PRRLSIN-cPPT.EF-1α-8E3-28Z。10A4-28Z序列由CD8α信号肽SEQIDNO:32、10A4scFvSEQIDNO:24、CD8hingeSEQIDNO:34、CD28跨膜区SEQIDNO:36和胞内信号传导结构域SEQIDNO:38以及CD3的胞内段CD3ξSEQIDNO:40组成；1A7-28Z序列由CD8α信号肽SEQIDNO:32、1A7scFvSEQIDNO:26、CD8hingeSEQIDNO:34、CD28跨膜区SEQIDNO:36和胞内信号传导结构域SEQIDNO:38以及CD3的胞内段CD3ξSEQIDNO:40组成；8E3-28BB序列由CD8α信号肽SEQIDNO:32、8E3-scFvSEQIDNO:28、CD8hingeSEQIDNO:34、CD28跨膜区SEQIDNO:36和胞内信号传导结构域SEQIDNO:38以及CD3的胞内段CD3ξSEQIDNO:40组成。2.质粒转染293T包装hu8E3-28Z慢病毒a取293T细胞消化后以1.25×107铺至15cm平皿，37℃培养至细胞汇合度为70％-80％，将上清换成10mL新鲜的10％FBS培基。b配制质粒PEI混合液取pRRL-hu8E3-28Z13.7ug、pVSV.G6.3ug、RRE16.4ug、REV16.4ug，加入2200uLDMEM中孵育。对应PEI量为165ul1ugul，加入2200uLDMEM中孵育5min。将质粒混合液加入PEI孵育液中，混匀，室温孵育20min，得到质粒PEI混合液。c将b配制的质粒PEI混合液逐滴加入a的细胞中，混匀，5h后进行换液，72h后收集病毒上清，以0.45um滤膜过滤后，加入PEG8000，4℃纯化过夜，4000rpm、4℃离心，收集病毒沉淀，得到hu8E3-28Z慢病毒。3.重组人慢病毒感染T细胞a将PBMC培养于AIM-V培基Gibco,#0870112+2％humanABserumGemini,#100-512中，加入重组人IL-2500Uml上海华新生物高技术有限公司，按照1:1细胞:磁珠比例加入CD3CD28磁珠Invitrogen，#21013活化T细胞，48小时后感染。bRetronectinTakara,#T100A包板4℃过夜，浓度5μgml。将活化好的T细胞按照1×106个细胞ml的密度加入Retronectin包好的板中，加入步骤2中收集的高纯度病毒后MOI≈10，1800rpm，32℃离心40min，离心完后放入培养箱中培养48h，换液AIM-Ⅴ培基+2％humanABserum、IL-2500Uml，去磁珠，其后细胞以5×105个细胞ml的密度培养6-10天，得到感染了hu8E3-28Z病毒的T细胞，即表达8E3-28ZSEQIDNO:48的T细胞。取5×105个8E3-28ZT细胞及未感染病毒的T细胞进行流式检测，检测8E3-28ZCAR在T细胞中的的表达，检测仪器为BeckmanCoulterEpicsXLFlowCytometer，结果如图11所示，在感染了hu8E3-28Z病毒的T细胞中都能检测到hu8E3-28ZCAR的表达。实施例9.8E3-28Z的CART细胞的细胞毒性检测取实施例8制备的hu8E3-28ZT细胞，检测对3T3-mFAP及H1080-huFAPα细胞的杀伤，方法如下：将3T3-mFAP单克隆细胞消化后计数，取表达8E3-28ZCAR的T细胞离心后计数。以3T3-mFAP细胞为靶细胞，效应细胞为表达8E3-28ZCAR的T细胞，效靶比分别为3:1、1:1、1:3，靶细胞数量为10000孔，根据不同效靶比设定不同数量效应细胞即30000孔，10000孔，3333孔。各组均设5个复孔。共孵育18h后通过CytoTox96非放射性细胞毒性试剂盒Promega，#G1780检测上清中LDH含量，计算其杀伤活性。具体参照CytoTox96非放射性细胞毒性试剂盒说明书。表达8E3-28ZCAR的T细胞对3T3、H1080及H1080-huFAPα细胞的杀伤毒性实验与3T3-mFAP细胞相同。如图12所示，表达8E3-28ZCAR的T细胞能够特异性杀伤表达鼠FAPα的3T3-mFAP细胞及表达人FAPα的H1080-huFAPα细胞。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表科济生物医药（上海）有限公司上海市肿瘤研究所靶向成纤维激活蛋白α的结合单元及其应用P2017-223848PatentInversion3.515PRT人工序列ArtificialSequence1SerTyrAlaIleSer15217PRT人工序列ArtificialSequence2GlyIleIleProIlePheGlyThrAlaAsnTyrAlaGlnLysPheGln151015Gly37PRT人工序列ArtificialSequence3AspAlaAlaAspArgAspTyr15416PRT人工序列ArtificialSequence4ArgSerSerGlnSerLeuLeuHisSerAsnGlyTyrAsnTyrLeuAsp15101557PRT人工序列ArtificialSequence5LeuGlySerAsnArgAlaSer1569PRT人工序列ArtificialSequence6GlnGlnArgAsnAsnLysAsnArgThr1575PRT人工序列ArtificialSequence7ProTyrThrIleSer15817PRT人工序列ArtificialSequence8GlyIleValProAsnValGlyValAlaThrTyrAlaGlnLysPheGln151015Gly916PRT人工序列ArtificialSequence9ArgSerSerGlnSerLeuLeuHisProAsnGlyPheAsnHisLeuTyr151015107PRT人工序列ArtificialSequence10ValGlyGlyAsnArgAlaSer1511116PRT人工序列ArtificialSequence11GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyGlyThrPheSerSerTyr202530AlaIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyGlyIleIleProIlePheGlyThrAlaAsnTyrAlaGlnLysPhe505560GlnGlyArgValThrIleThrAlaAspLysSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAspAlaAlaAspArgAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrVal100105110ThrValSerSer11512348DNA人工序列ArtificialSequence12caggtgcaattggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtc60tcctgcaaggcctccggaggcacattcagcagctacgctataagctgggtgcgacaggcc120cctggacaagggctcgagtggatgggagggatcatccctatctttggtacagcaaactac180gcacagaagttccagggcagggtcaccattactgcagacaaatccacgagcacagcctac240atggagctgagcagcctgagatctgaggacaccgccgtgtattactgtgcgagagatgct300gctgatagggactactggggccaagggaccaccgtgaccgtctcctca34813113PRT人工序列ArtificialSequence13AspIleValMetThrGlnSerProLeuSerLeuProValThrProGly151015GluProAlaSerIleSerCysArgSerSerGlnSerLeuLeuHisSer202530AsnGlyTyrAsnTyrLeuAspTrpTyrLeuGlnLysProGlyGlnSer354045ProGlnLeuLeuIleTyrLeuGlySerAsnArgAlaSerGlyValPro505560AspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLysIle65707580SerArgValGluAlaGluAspValGlyValTyrTyrCysGlnGlnArg859095AsnAsnLysAsnArgThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys100105110Arg14339DNA人工序列ArtificialSequence14gatattgttatgactcaatctccactgtctctgccggtgactccaggcgaaccggcgagc60atttcttgccgttccagccagtctctgctgcactccaacggctacaactatctcgattgg120tacctgcaaaaaccgggtcagagccctcagctgctgatctacctgggctctaaccgcgct180tccggtgtaccggaccgtttcagcggctctggatccggcaccgatttcacgttgaaaatc240agccgtgttgaagcagaagacgtgggcgtttattactgtcagcagcgtaataataagaat300cgtacttttggtcaaggcaccaaggtcgaaattaaacgt33915116PRT人工序列ArtificialSequence15GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyGlyThrPheSerProTyr202530ThrIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyGlyIleValProAsnValGlyValAlaThrTyrAlaGlnLysPhe505560GlnGlyArgValThrIleThrAlaAspLysSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAspAlaAlaAspArgAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrVal100105110ThrValSerSer11516348DNA人工序列ArtificialSequence16caggtgcaattggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtc60tcctgcaaggcctccggaggcacattcagcccctacactataagctgggtgcgacaggcc120cctggacaagggctcgagtggatgggagggatcgtccctaatgttggtgtagcaacctac180gcacagaagttccagggcagggtcaccattactgcagacaaatccacgagcacagcctac240atggagctgagcagcctgagatctgaggacaccgccgtgtattactgtgcgagagatgct300gctgatagggactactggggccaagggaccaccgtgaccgtctcctca34817113PRT人工序列ArtificialSequence17AspIleValMetThrGlnSerProLeuSerLeuProValThrProGly151015GluProAlaSerIleSerCysArgSerSerGlnSerLeuLeuHisPro202530AsnGlyPheAsnHisLeuTyrTrpTyrLeuGlnLysProGlyGlnSer354045ProGlnLeuLeuIleTyrValGlyGlyAsnArgAlaSerGlyValPro505560AspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLysIle65707580SerArgValGluAlaGluAspValGlyValTyrTyrCysGlnGlnArg859095AsnAsnLysAsnArgThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys100105110Arg18339DNA人工序列ArtificialSequence18gatattgttatgactcaatctccactgtctctgccggtgactccaggcgaaccggcgagc60atttcttgccgttccagccagtctctgcttcaccccaacggcttcaaccatctctattgg120tacctgcaaaaaccgggtcagagccctcagctgctgatctacgtggggggtaaccgcgct180tccggtgtaccggaccgtttcagcggctctggatccggcaccgatttcacgttgaaaatc240agccgtgttgaagcagaagacgtgggcgtttattactgtcagcagcgtaataataagaat300cgtacttttggtcaaggcaccaaggtcgaaattaaacgt33919743PRT人工序列ArtificialSequence19LeuArgProSerArgValHisAsnSerGluGluAsnThrMetArgAla151015LeuThrLeuLysAspIleLeuAsnGlyThrPheSerTyrLysThrPhe202530PheProAsnTrpIleSerGlyGlnGluTyrLeuHisGlnSerAlaAsp354045AsnAsnIleValLeuTyrAsnIleGluThrGlyGlnSerTyrThrIle505560LeuSerAsnArgThrMetLysSerValAsnAlaSerAsnTyrGlyLeu65707580SerProAspArgGlnPheValTyrLeuGluSerAspTyrSerLysLeu859095TrpArgTyrSerTyrThrAlaThrTyrTyrIleTyrAspLeuSerAsn100105110GlyGluPheValArgGlyAsnGluLeuProArgProIleGlnTyrLeu115120125CysTrpSerProValGlySerLysLeuAlaTyrValTyrGlnAsnAsn130135140IleTyrLeuLysGlnArgProGlyAspProProPheGlnIleThrPhe145150155160AsnGlyArgGluAsnLysIlePheAsnGlyIleProAspT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权利要求：1.一种抗原结合单元，所述抗原结合单元包含轻链CDR区和重链CDR区，所述的重链CDR包含HCDR1，HCDR2，和HCDR3；所述的轻链CDR区包含LCDR1，LCDR2，和LCDR3；其中，所述的HCDR1，HCDR2和HCDR3的序列独立选自下组：SEQIDNO:1-3、7和8，所述的LCDR1，LCDR2和LCDR3的序列独立选自下组：SEQIDNO:4-6、9和10。2.如权利要求1所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的HCDR1具有SEQIDNO:1或7所示的序列，所述的HCDR2具有SEQIDNO:2或8所示的序列，所述的HCDR3具有SEQIDNO:3所示的序列。3.如权利要求2所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的HCDR1，HCDR2和HCDR3的序列选自以下任一组：A.SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3；B.SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:3。4.如权利要求1所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的LCDR1具有SEQIDNO:4或9所示的序列，所述的LCDR2具有SEQIDNO:5或10所示的序列，所述的LCDR3具有SEQIDNO:6所示的序列。5.如权利要求4所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的LCDR1，LCDR2和LCDR3的序列选自以下任一组：A.SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6；B.SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:6。6.如权利要求1所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的HCDR1具有SEQIDNO:1或7所示的序列，所述的HCDR2具有SEQIDNO:2或8所示的序列，所述的HCDR3具有SEQIDNO:3所示的序列，所述的LCDR1具有SEQIDNO:4或9所示的序列，所述的LCDR2具有SEQIDNO:5或10所示的序列，所述的LCDR3具有SEQIDNO:6所示的序列。7.如权利要求6所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的HCDR1含有SEQIDNO:1所示的序列、所述的HCDR2含有SEQIDNO:2所示的序列、所述的HCDR3含有SEQIDNO:3所示的序列、所述的LCDR1含有SEQIDNO:4所示的序列、所述的LCDR2含有SEQIDNO:5所示的序列、所述的LCDR3含有SEQIDNO:6所示的序列；或者所述的HCDR1含有SEQIDNO:7所示的序列、所述的HCDR2含有SEQIDNO:8所示的序列、所述的HCDR3含有SEQIDNO:3所示的序列、所述的LCDR1含有SEQIDNO:4所示的序列、所述的LCDR2含有SEQIDNO:5所示的序列、所述的LCDR3含有SEQIDNO:6所示的序列；或者所述的HCDR1含有SEQIDNO:1所示的序列、所述的HCDR2含有SEQIDNO:2所示的序列、所述的HCDR3含有SEQIDNO:3所示的序列、所述的LCDR1含有SEQIDNO:9所示的序列、所述的LCDR2含有SEQIDNO:10所示的序列、所述的LCDR3含有SEQIDNO:6所示的序列。8.如权利要求1-7任一所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的抗原结合单元具有SEQIDNO:11或15所示的重链可变区，和SEQIDNO:13或17所示的轻链可变区。9.权利要求1-8任一所述的抗原结合单元的突变体，与权利要求1-8任一所述的抗原结合单元竞争结合FAPα。10.如权利要求9所述的突变体，其特征在于，所述突变体与权利要求1-8任一所述的抗原结合单元在轻链可变区序列上有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；或者，所述突变体与权利要求1-8任一所述的抗原结合单元在在重链可变区序列上有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；优选地，所述突变体与权利要求1-8任一所述的抗原结合单元在轻链CDR区，例如轻链CDR1或CDR2的序列上有70％以上；优选地，75％以上；更优选地，80％以上的相同性；或者，所述突变体与权利要求1-8任一所述的抗原结合单元在重链CDR区，例如重链CDR1或CDR2的序列上有60％以上；优选地，70％以上；更优选地，80％以上的相同性。11.如权利要求9所述的突变体，其特征在于，所述突变体与权利要求1-8任一所述的抗原结合单元竞争结合FAPα上同一结合表位。12.一种抗原结合单元，所述抗原结合单元包含轻链CDR区和重链CDR区，所述的重链CDR包含HCDR1，HCDR2和HCDR3；所述的轻链CDR区包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中，所述的HCDR1，HCDR2和HCDR3独立选自与SEQIDNO:1-3、7、8中任一序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列，所述的LCDR1，LCDR2和LCDR3独立选自与SEQIDNO:4-6、9、10中任一序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列。13.如权利要求12所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的HCDR1具有SEQIDNO:1或7所示的序列，所述的HCDR2具有SEQIDNO:2或8所示的序列，所述的HCDR3具有SEQIDNO:3所示的序列。14.如权利要求13所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的HCDR1，HCDR2和HCDR3的序列选自以下任一组：A.SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3；B.SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:3。15.如权利要求12所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的LCDR1具有SEQIDNO:4或9所示的序列，所述的LCDR2具有SEQIDNO:5或10所示的序列，所述的LCDR3具有SEQIDNO:6所示的序列。16.如权利要求15所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的LCDR1，LCDR2和LCDR3的序列选自以下任一组：A.SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6；B.SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:6。17.如权利要求12所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的HCDR1具有SEQIDNO:1或7所示的序列，所述的HCDR2具有SEQIDNO:2或8所示的序列，所述的HCDR3具有SEQIDNO:3所示的序列，所述的LCDR1具有SEQIDNO:4或9所示的序列，所述的LCDR2具有SEQIDNO:5或10所示的序列，所述的LCDR3具有SEQIDNO:6所示的序列。18.如权利要求17所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的HCDR1含有SEQIDNO:1所示的序列、所述的HCDR2含有SEQIDNO:2所示的序列、所述的HCDR3含有SEQIDNO:3所示的序列、所述的LCDR1含有SEQIDNO:4所示的序列、所述的LCDR2含有SEQIDNO:5所示的序列、所述的LCDR3含有SEQIDNO:6所示的序列；或者所述的HCDR1含有SEQIDNO:7所示的序列、所述的HCDR2含有SEQIDNO:8所示的序列、所述的HCDR3含有SEQIDNO:3所示的序列、所述的LCDR1含有SEQIDNO:4所示的序列、所述的LCDR2含有SEQIDNO:5所示的序列、所述的LCDR3含有SEQIDNO:6所示的序列；或者所述的HCDR1含有SEQIDNO:1所示的序列、所述的HCDR2含有SEQIDNO:2所示的序列、所述的HCDR3含有SEQIDNO:3所示的序列、所述的LCDR1含有SEQIDNO:9所示的序列、所述的LCDR2含有SEQIDNO:10所示的序列、所述的LCDR3含有SEQIDNO:6所示的序列。19.一种抗原结合单元，其特征在于，所述的抗原结合单元具有与SEQIDNO:11或15所示的重链可变区的序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列，和与SEQIDNO:13或17所示的轻链可变区具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列。20.如权利要求1-19任一项所述的抗原结合单元或抗原结合单元的突变体，其特征在于，所述的抗原结合单元是单克隆抗体、全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体。21.如权利要求1-19所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的抗原结合单元是scFv、Fv、Fab、Fab2或者单域抗体。22.编码权利要求1-21中任一所述的抗原结合单元的核酸。23.一种表达载体，其包含权利要求22所述的核酸。24.一种宿主细胞，其包含权利要求23所述的表达载体或基因组中整合有权利要求22所述的核酸。25.一种双价蛋白，由权利要求21所述的scFv序列与一个或多个重链恒定区域融合所形成具有人免疫球蛋白Fc区的抗体；优选地，所述的人免疫球蛋白Fc区连接有缀合物；优选的，所述缀合物优选自荧光染料、细胞毒素、放射性同位素。26.一种多功能免疫辍合物，其特征在于，所述的多功能免疫辍合物包括:权利要求1-21任一所述的抗原结合单元，以及与之连接的功能性分子；其中，所述的功能性分子选自:a靶向肿瘤表面标志物的分子，包括结合免疫细胞表面标志物的抗体或配体；较佳地，所述的免疫细胞表面标志物包括:CD3，CD16，CD28；更佳地，所述的结合免疫细胞表面标志物的抗体是抗CD3抗体；最佳地，所述的靶向免疫细胞的表面标志物的分子是结合T细胞表面标志物的抗体；b抑制肿瘤的分子,包括抗肿瘤的细胞因子或抗肿瘤的毒素，较佳的，所述的细胞因子包括:IL-12、IL-15、I型干扰素、TNF-alpha；c靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物。27.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的胞外域包含权利要求1-21任一所述的抗原结合单元，该抗原结合单元优选单链抗体或单域抗体。28.如权利要求27所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包括如下顺序连接的抗体，跨膜区和胞内信号区:权利要求1-21任一所述的抗原结合单元、CD8和CD3ζ；权利要求1-21任一所述的抗原结合单元、CD8、CD137和CD3ζ；权利要求1-21任一所述的抗原结合单元、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区和CD3ζ；或权利要求1-21任一所述的抗原结合单元、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区、CD137和CD3ζ。29.编码权利要求27或28所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。30.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求29所述的核苷酸序列。31.一种病毒，其特征在于，所述的病毒包含权利要求30所述的表达载体。32.一种基因修饰的免疫细胞，其特征在于，其转导有权利要求29所述的核苷酸序列、或权利要求30所述的表达载体、或权利要求31所述的病毒、或其表达权利要求27或28所述的嵌合抗原受体。33.如权利要求32所述的基因修饰的免疫细胞，其特征在于，还表达有除嵌合抗原受体之外的其他序列，所述其他序列包括细胞因子、另一种嵌合抗原受体、趋化因子受体、降低PD-1表达的siRNA或者阻断PD-L1的蛋白、TCR、或安全开关；较佳地，所述的细胞因子包括IL-12、IL-15、IL-21、或I型干扰素；较佳地，所述趋化因子受体包括CCR2、CCR5、CXCR2、或CXCR4；较佳地，所述安全开关包括iCaspase-9、TruancatedEGFR或RQR8。34.如权利要求1-21任一所述的抗原结合单元、或权利要求25所述的双价蛋白、或权利要求26所述的免疫辍合物、或权利要求27或28所述的嵌合抗原受体、或权利要求29所述的核苷酸序列、或权利要求30所述的表达载体、或权利要求31所述的病毒、或权利要求32或33所述的免疫细胞的用途，用于制备治疗、预防或诊断高表达FAPα相关的疾病的药物或试剂。35.如权利要求34所述的用途，所述的高表达FAPα相关的疾病是肿瘤。36.如权利要求35所述的用途，所述的肿瘤是乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、皮肤黑色素瘤、肾癌、膀胱癌。37.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-21中任一所述的抗原结合单元或编码该抗原结合单元的核酸；或权利要求25中所述的双价蛋白；或权利要求26中所述的免疫辍合物或编码该辍合物的核酸；或权利要求27或28所述的嵌合抗原受体或编码该嵌合抗原受体的核酸；或权利要求32或33中所述的基因修饰的免疫细胞。

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