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申请/专利权人：山东大学

摘要：本发明涉及一种近红外发光团超灵敏全自动化学发光法检测新冠抗原的方法，属于化学发光免疫分析技术领域。本发明采用含辅料的基底液，大幅提升近红外纳米粒子的稳定性，提升发光团的稳定性，在4℃的环境中存放理论值约660天，采用稳定性强的CdTeNCs构建的近红外化学发光体系，实现了化学发光试剂仅位于可见光区的突破，采用商品化全自动化学发光分析仪，打破纳米粒子类化学发光仅使用科研设备的局限性，构建了近红外纳米粒子发光的CdTeNCsKMnO4化学发光体系，降低了化学发光免疫分析的背景值，基于全自动化测试方式实现COVID‑2019的超快速与高灵敏检测，达到单分子检测水平。

主权项：1.一种近红外发光团超灵敏全自动化学发光法检测新冠抗原的方法，在5agmL-1000agmL的浓度范围内表现出良好的线性关系，检出限为2.5agmL，包括步骤如下：（1）含辅料的水溶性CdTeNCs分散液的制备：将制得的近红外水溶性CdTeNCs加入含辅料的基底液中，混合均匀，得到含辅料的水溶性CdTeNCs分散液，所述含辅料的基底液为β-巯基乙醇MCE、六偏磷酸钠SHMP添加到PBST溶液中制得；含辅料的基底液中β-巯基乙醇的浓度为14-17mmolL，六偏磷酸钠SHMP的浓度为10-15mmolL，含辅料的水溶性CdTeNCs分散液中CdTeNCs的浓度为0.5-3μmolL；PBST溶液为pH=7.4，浓度为10mmolL的PBS溶液，PBS溶液的配置方法如下：称取0.1867gK2HPO4、0.0259gKH2PO4和0.0749gKCl溶于100mL去离子水中配制成pH=7.4的10mmolLPBS溶液；PBST溶液的配置方法如下：向100mLpH=7.4的10mmolLPBS溶液中加入50μLTween-20，混匀后制得PBST溶液；近红外水溶性CdTeNCs是按如下方法制得：1）取1.6mL0.1molL的CdCl2∙2H2O，加入去离子水稀释至50mL，室温下搅拌；2）向步骤1）中加入293.6mg六偏磷酸钠；3）向步骤2）中加入36.4μL巯基丙酸；4）向步骤3）中加入1M氢氧化钠，调节pH至7.5；5）向步骤4）中加入5.3mg亚碲酸钠，100℃下回流10min；6）向步骤5）中加入2.4mL水合肼，100℃下继续回流36h，得到近红外水溶性CdTeNCs，近红外水溶性CdTeNCs产生的化学发光辐射波段位于790nm；（2）免疫标记复合物的制备：a、取含辅料的水溶性CdTeNCs分散液，加入含EDC和NHS的溶液进行活化羧基10-15分钟，然后加入稀释后的MCE，室温下反应4-8分钟，反应后加入COVID-2019二抗溶液，混匀，孵育1-4h，甘氨酸封闭，得到CdTeNCs标记的COVID-2019二抗，分散于PBST溶液中，得到CdTeNCs标记的COVID-2019二抗溶液；b、将链霉亲和素标记的磁珠溶液、生物素化COVID-2019一抗溶液，CdTeNCs标记的COVID-2019二抗溶液、标准已知浓度COVID-2019抗原溶液置于MCL60-SD全自动化学发光分析仪中，混合孵育，得到免疫复合物溶液；PBST溶液为pH=7.4，浓度为10mmolL的PBS溶液，PBS溶液的配置方法如下：称取0.1867gK2HPO4、0.0259gKH2PO4和0.0749gKCl溶于100mL去离子水中配制成pH=7.4的10mmolLPBS溶液；PBST溶液的配置方法如下：向100mLpH=7.4的10mmolLPBS溶液中加入50μLTween-20，混匀后制得PBST溶液；（3）免疫复合物溶液以KMnO4的PBS溶液作为激发液，使用MCL60-SD全自动化学发光分析仪采集化学发光信号，绘制化学发光信号和已知COVID-2019抗原浓度的标准曲线；KMnO4的PBS溶液中KMnO4的浓度为1-2mmolL，pH=7.4，KMnO4的PBS溶液的加入量为100-300μL，免疫复合物溶液的加入量为50-200μL；（4）以待测样品溶液替换标准已知浓度COVID-2019抗原溶液，按步骤（2）的方法孵育，按步骤（3）的方法测试，得到目标化学发光曲线；根据所得化学发光曲线上最高光强和标准曲线，得到待测样品溶液中的COVID-2019抗原的浓度。

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